高品質の最適化

Scientific Reports volume 13、記事番号: 4588 (2023) この記事を引用

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15 オルトメトリック

メトリクスの詳細

定期的な肺炎球菌結合型ワクチン（PCV）予防接種の直接的および間接的な影響を詳細に評価するには、同時に定着している肺炎球菌血清型を検出する高感度のツールが必要です。 ハイスループットの定量的ナノ流体リアルタイム PCR (Standard BioTools 'Fluidigm') 反応セットは、アーカイブされた臨床サンプル中の 92 種類の肺炎球菌血清型を検出および定量するために開発されました。 2009年から2011年に5歳以下の南アフリカの子供から採取され、標準的な培養ベースの方法で事前に血清型別された鼻咽頭スワブが比較のために使用されました。 「Fluidigm」内の反応セットは、高効率 (90 ～ 110%)、再現性 (R2 ≥ 0.98)、そして低い検出限界 (< 102 CFU/ml) ですべてのターゲットを効果的に増幅しました。 1,973 個の鼻咽頭スワブサンプルのブラインド分析では、参照対象の標準である培養ベースの Quellung 法と比較して、診断感度 > 80%、特異度 > 95% が示されました。 qPCR 法は、Quellung と比較して良好な識別力で肺炎球菌の型を血清型分類することができました (ROC-AUC: > 0.73)。 ハイスループットのナノ流体リアルタイム PCR 法は、1 回の qPCR 実行内で、57 の個別の血清型と、96 サンプル (対照を含む) 中の 16 血清群内の 35 の血清型を同時に検出します。 この方法は、同時にコロニーを形成する複数の血清型の検出を含め、ワクチン血清型および非ワクチン血清型のコロニー形成に対する現在の PCV 製剤の影響を評価するために使用できます。 当社の qPCR メソッドは、血清型特異的な細菌量のモニタリング、ならびに浸潤性疾患の可能性があるマイナーまたは共定着している血清型の出現または進行中の伝播をモニタリングすることができます。

肺炎球菌の莢膜は、血清型の不均一性を与える莢膜多糖合成 (CPS) 遺伝子座によって遺伝的にコードされた反復多糖で構成されています 1,2。 生化学的および血清学的に異なる S. pneumoniae 血清型が 100 種類あります 3。 莢膜の多様性は肺炎連鎖球菌の重要な病原性因子であり 4、血清型によってヒトに病気を引き起こす可能性が異なります 5。 肺炎球菌結合型ワクチン（PCV）は、疾患の前兆である肺炎球菌ワクチン血清型（VT）保菌の獲得を防ぎます6、7、8、9、10。 最初に認可された PCV (PCV7) は 7 つの血清型、すなわち 4、6B、9V、14、18C、19F、および 23F を対象としていました。 我々の環境で使用されている現在の PCV には、さらに 3 つの血清型 (PCV10: 1、5、および 7F) と 6 つの血清型 (PCV13: 1、3、5、6A、7F、および 19A) が含まれています。 次世代の 15 価および 20 価の PCV は臨床試験中であり、PCV13 と比較して、それぞれ追加の 2 つの血清型（22F および 33F）11 と 7 つの血清型（8、10A、11A、12F、15B、22F、および 33F）12 が含まれています。

上気道の肺炎球菌定着の監視は、集団レベルでの PCV 予防接種の影響を評価するのに役立ちます 13。 肺炎球菌の定着調査は、VT および非ワクチン血清型 (NVT) を含む複数の血清型の同時保有を検出できる、包括的で高感度かつ正確な血清型検査法を使用して実行するのが最適です。 ワクチン接種戦略や、異なる地理的地域に合わせた高価数または代替価数の PCV の利用について情報を提供するには、循環血清型の一貫した監視が必要です。 新たな血清型または代替血清型の検出用13。

培養ベースの Quellung 法は、依然として肺炎球菌血清型検査のゴールドスタンダードです。 ただし、これらの方法は時間がかかり、感度が低く、コストがかかります 14,15。 培養ベースの方法と比較して、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) ベースの検出と血清型別は、抗生物質の使用、サンプルの輸送および保管条件によって悪影響を受ける可能性のある微生物の生存率に依存せず、時間がかからず、より迅速な診断とより高い感度を提供します 15 。 従来のリアルタイム PCR は、ゲルまたはキャピラリー電気泳動を用いたシングル チューブ ネステッド PCR およびマルチプレックス PCR を含み、ドットブロット検出、培養濃縮、およびシーケンスベースの分析と組み合わせて使用​​されてきました 16、17、18、19、20、21、22。 23、24、25、26、27、28。 リアルタイム PCR 法が開発され、ハイスループット システム 15、32、33 を含め、検出される血清型の数が増加しています 21、29、30、31。 さらに、細菌量を決定するために検証された定量的 PCR (qPCR) 法 29,31,32,34 は、公衆衛生プログラムにおけるワクチンの影響を評価するために重要です。 鼻咽頭における細菌量の増加は、血清型特異的な浸潤性疾患の可能性を予測する可能性があります 31。

以前に我々は、55 種類の肺炎球菌血清型 32 を同時に検出および定量できるナノ流体 qPCR 反応セットと、血清群 6A/B/C/D、18A/B/C、および 22A/F を区別するための検出およびタイピング方法を開発しました。同じプラットフォームを使用して単一の血清型35に分割します。 ここでは、追加の 38 の血清型を検出および定量する方法を拡張します。これにより、包括的な肺炎球菌の血清型判定 (92 血清型) と他の 15 種類の細菌種の検出が可能になり、呼吸器サンプル中の定着と細菌量を評価できます。

社内のナノ流体、ハイスループット、リアルタイム PCR プラットフォーム内で、肺炎連鎖球菌の血清型を判定し、鼻咽頭に存在する可能性のある他の種を検出するための包括的な反応セットを開発するために、公開されているアッセイセットのレビュー (プライマーおよびプローブ）シーケンスを実施しました。 血清型 19B (CR931676) および 19F (CR931678) 莢膜遺伝子、肺炎球菌 Xisco 推定タンパク質遺伝子 (NC_003028)、およびインフルエンザ菌 Bex カプセル化遺伝子 (X54987) の代表的な GenBank FASTA 配列を、ClustalW マルチアライメントを使用して BioEdit でアラインメントしました 36,37。 標準プライマーおよび色素標識 MGB プローブは、19F 莢膜多糖遺伝子を検出して 19F と 19B1,2 を区別し、肺炎球菌の Xisco 遺伝子を検出し、インフルエンザ菌 BexA 遺伝子を検出するように手動で設計されました。 補足表S1にリストされている各アッセイセットの厳選されたすべてのオリゴヌクレオチド配列は、Basic Local Alignment Search Tool（NCBI BLAST; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を使用してインシリコで特異性を確認するために分析されました。反応セットに含める前。 各アッセイセット内の個々のオリゴヌクレオチドの融解温度 (Tm) は、オンライン ツール Oligocalc38 および Integrated DNA Technologies (IDT) OligoAnalyzer (http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/) を使用して決定し、評価しました。均一な熱プロファイルおよび多重化に含めるための適合性。 IDT OligoAnalyzer ツールを使用して、二次構造と自己結合部位を評価しました。 ナノ流体ハイスループットリアルタイム qPCR (「Fluidigm」、Standard BioTools) 内の連結反応セットの分析有効性 (効率、感度、特異性) と診断性能 (感度、特異性、一致性) は、キャリブレーターによって確立されました。それぞれ臨床サンプルとなります。

対照株を標準的なマイクロタイター培養法に従って増殖させ、定量キャリブレーターとして使用するための相対密度をコロニー形成単位 (CFU/ml) として定量化し、分析効果を評価しました。 前述のように、全 DNA を抽出し、アッセイまで -30 °C で保存しました 35。 含まれる肺炎球菌血清型を代表する 89 の分離株と他の 15 の細菌からの DNA を使用して、PCR アッセイセットを最適化し、それぞれの標的 (肺炎球菌血清型: 1; 2; 3; 4) に対するアッセイセットの分析特異性を評価しました。 ; 5; 6A; 6B; 6C; 6D; 7A; 7B; 7F; 7C; 8; 9A; 9L; 9N; 9V; 10A; 10B; 10C; 11A; 11B; 11C; 11D; 11F; 12B; 12F; 13 ; 14; 15A; 15B; 15C; 15F; 16A; 16F; 17A; 17F; 18A; 18B; 18C; 18F; 19A; 19B; 19C; 19F; 20; 21; 22A; 22F; 23A; 23B; 23F; 24あ; 24B; 24F; 25A; 25F; 27; 28A; 28F; 29; 31; 32A; 32F; 33A; 33B; 33C; 33D; 33F; 34; 35A; 35C; 35F; 35B; 36; 37; 38; 39 ; 40; 41A; 42; 43; 44; 45; 46; 47A; 47F; 48; アシネトバクター・バウマニ、ボルデテラ・ホルメシ、パラ百日咳菌、百日咳菌、大腸菌、インフルエンザ菌-b、型分類不能なインフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎球菌、モラクセラ・カタルハリス、ナイセリア・ラクタミカ、髄​​膜炎菌、黄色ブドウ球菌、アルガラクチエ菌、化膿連鎖球菌）。 対照分離株は、南アフリカの国立感染症研究所（NICD）、オーストラリアのマードック小児研究所（MCRI）、ソウェトの南アフリカ医学研究評議会ワクチン・感染症分析研究ユニット（Wits-VIDA）から入手した。 、 南アフリカ。

合成二本鎖 DNA (dsDNA) テンプレート遺伝子フラグメント (gBlock) を、分析有効性とアッセイ内およびアッセイ間の変動のための外部キャリブレーター (補足表 S2 および S3) として利用しました。 gBlock には、それぞれのアッセイセットが含まれるプール (補足表 S4) に従って、各肺炎球菌血清型または他の細菌標的の配列が含まれていました。 これらは、反応セットの分析感度 (検出限界) と再現性 (アッセイ内およびアッセイ間の変動と Levy-Jennings プロット) を評価するために適用されました。 各 gBlock の設計、プロパティ、シーケンスについては、以前に詳しく説明しました 35。 簡単に言うと、3 つのプール (A、B、および C、補足表 S4) のそれぞれについて、それぞれ 9 ～ 13 のターゲット領域を含む 3 つの gBlock (合計 9) が設計されました。 すべてのテンプレートが等モル比であるため、gBlock 内のターゲット配列を簡単に定量できます。 gBlock 合成 DNA の量は、Thermo Fisher Invitrogen Qubit 2.0 Fluorometer Qubit 2.0 と Invitrogen Qubit dsDNA BR Assay Kit を使用して測定しました。 コピー数、または同等の遺伝子の数は、次の式を使用して計算されました。

この量は、3 つの Qubit 測定の平均にアボガドロ数 (6.022 × 1023) を乗算したものです。 塩基対の長さに dsDNA ヌクレオチドの平均重量 (660 ダルトンまたは g/モル) を掛けて、ng (1 × 109) に換算し直しました。

2009年5月から10月までと2010年5月から2011年2月にかけて、5月に始まった南アフリカにおけるPCV7導入の初期段階における血清型特異的な肺炎球菌の定着を評価するために、それぞれムプマランガ州アジンコートとハウテン州ソウェトで2回の保菌調査が実施された。 200939,40。 これらの断面調査から得られた保菌株は、標準的な微生物学的方法を使用して事前に培養され、Quellung 法を使用して血清型が特定されました。 ここでは、肺炎球菌の定着が最も高かった年齢層における肺炎球菌の血清型判定の方法を評価するために、0 歳から 5 歳までの小児から採取した保存済みの鼻咽頭スワブ (NPS) をすべて含めました (図 1)。 遡及的に、培養結果に関係なく、サンプルが枯渇した場合や Quellung の結果が入手できない場合を除き、アーカイブされたすべてのサンプルを「Fluidigm」で再検査し、図 1 に概要を示すように、臨床サンプルでの正確な血清型判定のための反応セットを検証しました。現在の分析に利用できる 1973 のアーカイブされた臨床サンプルのうち、69.2% が培養により肺炎球菌陽性でした。

培養ベースの Quellung 法を使用して事前に血清型別され、Standard BioTools の「Fluidigm」リアルタイム定量および血清型別 PCR と比較された、含まれるアーカイブされた臨床サンプルを説明する検証フローチャート。 A09C は、Agincourt (2009) の子供から収集されたサンプルを示します 39。 S10C は、ソウェト (2010/11) の子供たちからのサンプルを示します40。 サンプルは、「検証用の臨床サンプル (鼻咽頭スワブ)」セクションに記載されているように、STGG に保存された鼻咽頭スワブであり、培養ベースの Quellung 法を使用して事前にテストされました 39,40。 アーカイブされた臨床サンプルを使用して、「Fluidigm」qPCR の診断性能を評価しました。 サンプルが欠落/枯渇していると示されている場合、これらのサンプルは以前の検査で使い果たされているか、サンプルバイアルが見つからなかったため、核酸抽出に使用できませんでした。 サンプルが失敗/枯渇として示されている場合は、核酸抽出が失敗し、この抽出を繰り返すにはサンプルが十分に残っていないことを意味します。 対照サンプルは、「Fluidigm」qPCR の分析性能を評価するために使用される培養株であり、方法の「全核酸抽出」セクションで説明されています。 抽出されたすべてのサンプルとコントロールは「Fluidigm」で実行されましたが、Quellung 結果 (陽性または陰性) を持つサンプルのみが診断性能の比較に含まれました。

-80 °C で保存したサンプル (スキムミルク - トリプトン - グルコース - グリセリン輸送媒体 [STGG] 中の NPS) を解凍し、低速で 30 秒間ボルテックスしました。 標準的な製造業者のプロトコールに従って、自動化BioMérieux NucliSens easyMAG (BioMérieux、Marcy l'Etoile、France)核酸抽出プラットフォームを使用して、400μlのSTGGから核酸を抽出し、100μlの溶出緩衝液に溶出した。 抽出された 23 臨床サンプルの各バッチには、ブランク STGG である 1 つのテンプレートなしコントロール (NTC) が含まれていました。 核酸はアッセイするまで -30 °C で保存されました。

特異的標的増幅（STA）は、前述のように、Biomark HD システム（Standard BioTools、旧 Fluidigm）の初期ステップ（DNA の前増幅）としてメーカーの推奨に従って実行されました 35。 つまり、プライマーの交差反応性を防ぐために、アッセイセット（プライマーのみ）を3つのSTAマルチプレックスプール（補足表S3）に分けました。 STA の後、Standard BioTools 96.96 Gene Expression (GE) Dynamic Array 集積流体回路 (IFC) (製品番号 BMK-M-96.96) または Flex Six 12.12 GE IFC (製品番号 100-6308) のいずれかで qPCR を実行しました。それぞれ、アレイあたり 9,216 の個別 qPCR 反応用に 96 サンプルと 96 アッセイセットを組み合わせた反応セット、またはアレイあたり 144 反応用に 12 サンプルと 12 アッセイセットを組み合わせた反応セットです。 Standard BioTools (「Fluidigm」) 96.96 IFC の準備と読み込みのフロー図は補足図 S1 に詳細に示されており、以前に詳細に説明されています 35。 簡単に説明すると、各サンプルについて、3 つのプールのそれぞれからの STA 製品 (5 μL) と分子グレードの H2O 10 μL を組み合わせて、残りのプライマーを希釈しました。 続いて、各ターゲットのアッセイプレミックスを、反応およびサンプルあたり最終濃度 9 µM プライマーおよび 2.5 µM プローブとなるように IFC アッセイ入口に吸引しました (プールされた STA 製品 2.25 µL、Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Master Mix、カタログ番号 4370074 2.50 µL)。および 0.25 µL の標準 BioTools/Fluidigm サンプルローディング試薬) をサンプル入口に吸引しました。 次に、メーカー提供の熱サイクル条件 (50 °C で 2 分間、70 °C で 30 分間、25 °C で 10 分間、50 °C で 2 分間、96.5 °C で 1 分間) を使用して、BiomarkHD サーモサイクラーで IFC を実行しました。 10 分間、その後 96 °C で 15 秒、60 °C で 60 秒を 40 サイクル。 結果は、Fluidigm リアルタイム PCR 分析ソフトウェアを使用して分析されました。 ここでは、しきい値は手動で定義されました。 ベースラインは自動的に割り当てられ、定量化サイクル (Cq) のカットオフ値 38 が適用されました。

回帰検量線（標準曲線）は、標的ポジティブコントロール株または gBlock の 10 倍連続希釈を 2 回使用して、各アッセイセットに対して作成されました。 標準曲線には 5 つのデータ ポイントが含まれていました。 線形定量化サイクル (Cq) 値を含まない範囲の終わりの外れ値は、線形ダイナミック レンジと決定係数 (r2) 値を定義するために削除されました。 テンプレート濃度が高い場合、PCR 阻害剤の濃度はより高くなりますが、高度に希釈されたサンプルでは、​​確率的結合により増幅にばらつきが生じます。 したがって、濃縮または希釈されたテンプレート、あるいは希釈エラーは増幅効率に影響を及ぼし、予測不可能な Cq 値をもたらします。 線形性の限界外にある値は、線形方程式によって予測されなくなります。 このため、外れ値は除外されます。 含まれる各アッセイセットの効率 (%) は、次の方程式を使用して標準曲線から生成された一次方程式 (y = mx + c) の傾き (m) から導出されます。

線形ダイナミックレンジの下端（μLあたり103～100コピー）にある細菌対照株またはgBlockの3連の希釈系列を使用して、最低CFU/mLまたはコピーとして定義される分析感度または検出限界（LOD）を決定しました。 「Fluidigm」qPCR の 3 回で検出されました。 対象となる肺炎球菌血清型またはその他の細菌種の DNA ライブラリーを平均 103 ～ 104 CFU/mL で調製しました。 分析特異性は、「Fluidigm」qPCR の各アッセイセットに対して DNA ライブラリーを実行することによって評価されました。

規定の効率範囲内（90 ～ 110%）のアッセイセットについては、キャリブレーター（対照株および既知密度の gBlock）の標準曲線から生成された一次方程式を使用して細菌密度の相対定量を外挿しました。 :

複数のアッセイセットで血清型が検出または決定された場合、平均密度が計算されました。 たとえば、血清型 6A の密度を計算するには:

血清型間の相対密度は、複数の同時血清型保菌における階層を割り当てるために使用され、プライマリ血清型は最も高い密度を持つ血清型であり、準優勢または共定着する血清型は相対密度が低い血清型です。 LytA と PiaB の密度を比較し、平均肺炎球菌密度 (LytA および PiaB) をサンプルごとの血清型密度の合計と比較するために、ブランド アルトマン プロット (差と平均) を構築しました。

診断感度は、以前に培養され、Quellung 法を使用して血清型別された保存臨床サンプル (n = 1973、図 1) の盲検再分析を通じて評価されました。 抽出された NTC および定量キャリブレーター (表 2 および 3 にリストされている gBlock、または 104 および 103 CFU/mL のコントロール株) を含む 96.96 IFC 内の qPCR 反応セットを使用してサンプルを再テストしました。 マクネマー検定を使用して、qPCR 反応セットでの血清型検出を Quellung 法の検出と比較しました。 陽性血清型が割り当てられるには、サンプルが肺炎球菌参照遺伝子 LytA と PiaB の両方に対して陽性である必要がありました。 これらの肺炎球菌遺伝子が検出されなかったが、血清型特異的アッセイセットが陽性であった場合、血清型は割り当てられませんでした。 p値が0.05以下の場合、「Fluidigm」qPCRとQuellungによる血清型指定は異なるとみなされました。 コーエンのカッパ係数を使用して、臨床サンプルごとの「Fluidigm」qPCR と Quellung の血清型固有の一致を決定しました。 カッパ値 < 0.20、0.21 ～ 0.40、0.41 ～ 0.60、0.61 ～ 0.80、および 0.81 ～ 1.00 は、それぞれ、一致が悪い、一致している、中程度、良好、および優れているとみなされました。 分析は、血清型割り当てに関連するアルゴリズムの適用を含め、Stata バージョン 13.0 で行われました。

再現性 (アッセイ内分散) は、103 遺伝子当量で同じ IFC 内で 3 回実行された gBlock の Cq の分散の標準偏差 (SD) を使用して決定されました。 再現性 (アッセイ間分散) は、4 つの異なる IFC 間の gBlock の Cq 分散の標準偏差として定義されました。

最初のサンプル収集については、ウィットウォータースランド大学の人間医療倫理委員会 (HREC) から倫理的承認を得ました (ソウェト コホート HREC: M090115; アジンコート コホート HREC: M090114)。 サンプルを採取した最初の研究の一環として、参加者のすべての法的保護者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。 この分析における分子法とサンプルの使用は、ウィットウォータースランド大学の HREC (HREC: M170314) によって承認されました。 すべての方法は、適切な臨床実施のための関連する国内および国際的なガイドラインおよび規制に従って実行されました。

合計 96 のアッセイセットが、最終的な「Fluidigm」qPCR 反応セットに含まれました。 qPCR では、92 の肺炎球菌血清型を検出し、これらを 16 グループおよび 57 の個別型の 35 の血清型に区別し、他の 15 の細菌種を同定できました (図 2、補足表 S4)。

「Fluidigm」反応セットによって検出された 92 の肺炎球菌血清型 (57 の個別の血清型、および 16 の血清群内の 35 の血清型) の概要ウェブ。 灰色で強調表示されているのは、PCV7 血清型: 4、6B、9A/V、14、18C、19F、23F です。 PCV10 血清型: PCV7 血清型および 1、5、7A/F。 PCV13 血清型: PCV10 血清型および 3、6A、および 19A。 NVT: PCV13 には含まれない血清型。

反応セット全体の増幅効率は、91 のアッセイセットで優れており、規定範囲の 90 ～ 110% 内にありました (表 1)。 これらのアッセイセットでは、データポイントは回帰曲線の一次方程式 (r2 > 0.98、表 1) によって正確に予測され、線形方程式の傾きを使用して細菌負荷の相対定量化が可能になりました。 これらのアッセイセットの線形ダイナミック レンジは少なくとも 5 対数倍でした。 さらに、アッセイセット固有の参照キャリブレーターを使用して構築された Levy-Jennings プロットは、すべてのプレートにわたる平均 Cq 値の ± 2.0 SD 以内でした。 これにより、設計されたキャリブレーター (gBlock) の使用が検証されました。 大腸菌、ニューモシスチス・ジロベシ、S.アルガラクティエ、肺炎連鎖球菌のXisco遺伝子、および細菌16SリボソームRNA遺伝子（補足表S1にリストされている）を検出するためのアッセイセットは、この反応セット内ではうまく機能しませんでした。効率が < 90% または > 110% または r2 < 0.98 であったためです (補足表 S5)。

分析感度は、含まれる 91 のアッセイセットで高かった (LOD: 10 ～ 100 遺伝子相当、表 1)。 アッセイセットは一貫して実行され、反復 (n = 3) の Cq 値は、反応プレート内 (アッセイ内) または連続した反応プレート (アッセイ間) で平均値の ± 0.1 SD 以内で同時に増幅されました。 「Fluidigm」qPCR 内の 96 のアッセイ セットのうち、94 のアッセイ セットはターゲットの細菌コントロール キャリブレーターに特異的であり、アッセイ セット間に交差反応性は観察されませんでした。 2 つの反応セット、つまり 10A と 33B は、同じグループ内の他の血清型、つまりそれぞれ 10B と 33C を検出しました。 したがって、これらのアッセイセットはそれに応じて名前が変更されました。10A は 10A/B に、33B は 33B/C に名前が変更されました。 対象となるすべての細菌株に対するすべてのアッセイセットの検出パターンに基づく血清型別アルゴリズムを適用して、いくつかの個別の血清型、すなわち 6A、6B、6C、6D、10A、11E、12A/F/44、18A、18B、 18C、18F、19B、22A、23A、38、37、33AF、35F、47A、47F、分類不能な肺炎球菌、非b型インフルエンザ菌、分類不能なインフルエンザ菌、百日咳菌、B .holmesii および B.parapertussis (表 2)。 血清型 10B および 33C のアッセイセットは反応セット内に含まれていたため、10A および 33B はこれらのそれぞれのアッセイセットでは検出されなかったため、アルゴリズムによる血清型割り当ての特異性は交差反応する血清型の影響を受けませんでした。 たとえば、血清型 10A はアッセイ セット 10A によって検出され、アッセイ セット 10B では検出されないため、血清型 10A が割り当てられます。 一方、血清型 10B はアッセイセット 10A およびアッセイセット 10B によって検出されるため、血清型 10B が割り当てられます。

診断性能は Quellung 法と比較されたため、これは肺炎球菌血清型にのみ適用されました。 さらに、「Fluidigm」の診断性能は、培養ベースの方法を使用してアーカイブされた臨床サンプルで以前に検出されなかった細菌種または肺炎球菌血清型を対象としたアッセイセットについては評価できませんでした（表3の脚注に記載）。 「Fluidigm」qPCR 法は、対象標準 (Quellung) と比較して肺炎球菌血清型を正確に分類することができ、受信者オペレーター曲線下面積 (ROC-AUC) は、比較したすべてのアッセイセットで 0.73 を超えていました (表 3)。 「Fluidigm」qPCR は、36 のアッセイセットの 1,973 件のアーカイブされた臨床サンプルにおいて、> 80% の感度でターゲットを識別しました (表 3)。 6 つのアッセイセット (1; 7B/C/40; 23A; 29; 33B および 35A/C/42) の診断感度は、Quellung によって検出された標的血清型の有病率が低いほど低かった (50 ～ 74%、表 3)。は 1% 以下でしたが、「Fluidigm」qPCR を使用して追加の標的血清型が検出されました (図 3)。 残りのアッセイセットは、上で説明したように評価できませんでした。 診断特異性は、標的血清型が以前に Quellung によって検出されたすべてのアッセイセットで高かった (> 95%) (表 3)。

「Fluidigm」qPCR 反応セットによって検出された個々の肺炎球菌血清型の有病率を、培養ベースの Quellung 法と比較したもの。 「Fluidigm」と Quellung の両方でサンプルから検出された血清型は一致すると分類されますが、一方の方法のみで検出されたサンプルは追加の血清型として分類されます。

培養と「Fluidigm」qPCR の間には良好な一致があり、かなり一致した血清型/グループ 1、5、および 23A を除き、アッセイセットの大部分が両方の方法で同じ血清型 (カッパ 0.61 ～ 0.8) を検出しました。 (カッパ 0.41 ～ 0.60)、および中程度の一致 (カッパ 0.21 ～ 0.40) を示した血清型 7A/F、11B/C、12A/F/44、33A/F、35A/C/42、35F、および 38。 一致が中等度または中程度と評価された場合、これは、Quellung (血清型 5、23A、12A/F/44、35A/C/42 および 38) と比較して、「Fluidigm」qPCR による追加のサンプルでこれらの血清型が検出されたことによるものです。さらに、Quellung 法で検出されたサンプルが合計 5 つ未満だった場合 (血清型 1、7A/F、11B/C、33A/F および 35F) (図 3)。 1 つのアッセイセット (血清型 29) では、一致度は低いと評価されました (κ < 0.20)。 このターゲットでは、「Fluidigm」qPCR により、培養ベースの Quellung 法を使用して血清型 29 と特定された 2 つのサンプルのうち 1 つが検出されましたが、Quellung を使用して陰性だったさらに 8 つのサンプルは、「Fluidigm」qPCR を使用して血清型 29 と特定されました。 「Fluidigm」qPCR は、血清型 6C、7A/F、7B/C/40、9L/N、10A、11B を除き、培養に比べてすべての各血清型/グループの検出感度が高かった (マクネマー検定: p < 0.05; 表 3)。 /C、15B/C、18C、20、21、22F、23B、25A/Fおよび33Bでは、2つの方法間で検出された分類に差異はありませんでした(マクネマー検定: p > 0.05; 表3)。 「Fluidigm」反応セットは、表 3 の比較アッセイセットの培養で検出された血清型を上回るさらに 39.1% (826/2113) の血清型を同定できましたが、逆に培養では 132 (1419 個中 9.3%) の血清型が検出され、同定されませんでした。 「Fluidigm」qPCRによる（表3、図3）。

すべての血清型と細菌標的の GMD (幾何平均密度) は補足表 S6 に示され、補足図 S2 にまとめられます。また、共定着する肺炎球菌血清型の階層は補足表 S7 に示されます。 「Fluidigm」qPCR によって検出された追加の血清型のうち、72.6% (831/1 144) が同時コロニー形成、つまり一次血清型または最高密度の血清型と比較して低密度の血清型でした。 「Fluidigm」qPCR によって検出された追加の血清型の GMD は、「Fluidigm」qPCR と Quellung の間で血清型指定が一致した場合よりも低かった [2.3 (95% 信頼区間/CI: 2.2-2.4) および 4.1 (95% CI: 4.0) -4.2); 図4]。

幾何平均密度 (GMD) は、「Fluidigm」qPCR によって決定された Log10 遺伝子当量 (GE)/mL として表されます。 一致する血清型 (青) は、参照標準培養に基づく Quellung 法と「Fluidigm」の両方によって検出されました。 追加の血清型は、「Fluidigm」qPCR のみで検出された血清型です (赤色)。

ブランド-アルトマンプロットを使用して比較した場合、LytAおよびPiaBアッセイセットから計算された肺炎球菌密度の間には優れた一致がありました（バイアス線：-0.2）（補足図S3A）。 さらに、狭い 95% CI (-1.7 ～ 1.3) の外にあったのはデータ ポイントの 6.9% (58/836) だけでした。 平均肺炎球菌密度（LytAおよびPiaB）とすべての血清型密度の合計（すべての血清型特異的アッセイセット）の間の一致は5.8％（45/776）で許容可能でした（バイアス線：-1.2、補足図S3B）。 95% CI (-6.7 ～ 4.0) の外にあるデータ。 肺炎球菌陽性のサンプルの 7.8% (65/836) では血清型は検出されず、さらに 3.6% (30/836) では肺炎球菌密度と総血清型密度の差がブランド基準の上限 CI を上回っていました。アルトマンプロット。

当社は、反応プレートあたり 96 検体 (キャリブレーターを含む) 内の 92 種類の肺炎球菌血清型およびその他の定着細菌を正確に検出および定量できる、高感度、特異的、および再現性のあるナノ流体 qPCR 反応セットを開発および検証しました。 ここで説明するアッセイセットの性能は、Standard BioTools の「Fluidigm」プラットフォーム 32,33 や LOD (< 103 CFU/ml) 用の TaqMan Array Cards 15 など、肺炎球菌保菌を検出するための他のハイスループット反応セットと同等です。 ; 効率 (90 ～ 110%)。 線形ダイナミック レンジ (5 倍) と線形性 (R2 > 0.98)。 注目すべきことに、96 のアッセイ セットを含むここで説明する「Fluidigm」qPCR パネルによる追加の血清型の検出 (39.1%) は、48 のアッセイ セットを含む前述の「Fluidigm」パネル (同じく 39.1%) に匹敵します 32。 ゴールドスタンダードの培養ベースの Quellung 法と比較して、当社の反応セットは肺炎球菌血清型の分類に関して 98.8% の精度がありました。 さらに、qPCR 反応セット全体の平均感度は Quellung と比較して 89.1% でした。

これまでの分子血清型分析技術では、一般的な血清型が検出されてきました。 ただし、その他の新興または珍しい NVT は検出されませんでした。 搬送中の VT が NVT に置き換わるにつれて、よりハイスループットな方法で検出可能な血清型の配列を拡大することがますます重要になっています 41,42,43。 また、培養ステップを介さずに臨床検体から直接、細菌量または細菌密度を複数の血清型保菌（共定着）を検出して割り当てることも重要であり、これは標準的な培養ベースの方法に対する分子技術の利点です44。 以前、不完全な血清型決定は、血清型の蔓延が他の地理的地域とは異なる我々の環境（南アフリカ）における分子血清型決定の欠点として説明されてきました45,46。 私たちの知る限り、ここで説明する「Fluidigm」qPCR 法は、これまでに開発された最も包括的なハイスループット定量的分子血清型分析反応セットです。

特に、Pai ら 25,26 は、29 の一般的な血清群/型を決定し、その後 40 の特異な血清型に順次絞り込むための従来のマルチプレックス PCR 法を開発しました。 Azzariら21は、リアルタイムPCRを使用して21の血清型を検出した。 その後、Sakai ら 29 は、72 の血清型/グループを検出するための 27 の新しいアッセイセットを設計しました。 Pholwat et al.15 は、カードあたり最大 7 つの臨床サンプルの 74 の血清型をカバーする PCR ベースのマイクロ流体 TaqMan アレイ カード (TAC) を最適化しました。 sacai ら 30 はさらに、46 の個別の血清型と 20 の血清群内の 33 の血清型を検出する qPCR 反応セットを開発しました。 「Fluidigm」では、Dhoubhadel ら 33 が SYBR Green 化学を使用して 50 の血清型 (16 の個別の血清型と 13 のサブグループ) を検出しました。 Messoudi et al.31 は、Pai et al.26 のアッセイセットを逐次リアルタイムマルチプレックス PCR に応用し、Locked Nucleic Acid (LNA) 修飾プローブを使用して 40 の血清型またはグループを検出しました。 これらの研究を総合すると、分子血清型分析の開発がさらに進み、当社の「Fluidigm」qPCR で使用する有用なアッセイセットが提供されました。このアッセイセットは、16 の血清群と 57 の個別の血清型を区別して、92 の肺炎球菌血清型を検出および定量するためにマルチプレックス STA プール内でさらに最適化されました。 私たちの研究以前は、修飾プローブはマイクロまたはナノ流体 PCR システムなどのハイスループット システムでは利用されておらず、Standard BioTools の「Fluidigm」プラットフォームでも推奨されていませんでした。 私たちの研究は、これらの修正されたプローブ戦略がハイスループットの「Fluidigm」ナノ流体 qPCR でうまく機能することを示しました。

高い細菌量、伝播リスク、血清型の侵襲性の間には病因的な関連性があるため、保菌研究における細菌量の定量化はワクチンの影響を評価するために重要です。 血清型 12F、8、24F、33F、38、および 10A とは別に、保菌血清型置換に関与する NVT は、症例対保菌率の分析によれば、侵襲性が低いことが示されています 47,48。 しかし、分子研究では、細菌密度が高いと、これらの定着血清型の侵入可能性が予測される可能性があることが示されています。 PCV15 (22F、33F) および PCV20 (8、10A、11A、12F、15BC) に含まれる追加の血清型のうち、「Fluidigm」qPCR ではさらに 0.3% の血清型 8 が同定されました。 10Aの0.4%。 11A/D の 1.0%。 12A/F/44 の 0.7%。 培養物と比較して、15B/C では 0.9%、33A/F では 0.6%。 同義の血清型について侵襲性分離株の鼻咽頭細菌量を無症候性保菌分離株と比較した分子研究（複数施設：南アフリカ、ブラジル、マリ、カンボジア、フランス）では、侵襲性分離株の平均細菌量が5倍高いことが判明した（263.4×105 CFU） /ml; ± 57.07 × 105 対 49.9 × 105 CFU/ml ± 67.4 × 105)31。

細菌の蔓延は、将来の感染のリスクを高める細菌量と本質的に関連している可能性もあります。 たとえば、急性呼吸器感染症（ARI）で入院した5歳未満の小児と、年齢が一致する健康な小児を対象としたベトナムの研究では、血清型特異的な細菌量と有病率が比較された。 ここで、血清型ごとの細菌量が高いことは、ARI 症例 (スピアマンのρ = 0.44、n = 186; p < 0.0001) と健康な小児 (スピアマンのρ = 0.41、n = 115; p < 0.0001) の両方で高い有病率と関連していました。

私たちの反応セットには、以前に公開された 19F-Atypical、19C、および 23A のアッセイセットは含まれていませんでした。 しかし、インシリコ解析では、これらのアッセイセットがそれぞれのターゲットを検出しないという兆候は見つかりませんでした。また、これらのアッセイセットは他の研究でもうまく機能しました 15、29、30。 血清型 23A は、血清型 23 (23A/B/F) アッセイセットと血清型 23B および 23F をターゲットとしたアッセイセットの結果を組み合わせたアルゴリズムを使用して、反応セットで依然として検出されました。これにより、サンプルは 23A/F 陽性となりました。 B/F であるが、23B および 23F が陰性の場合は、23A と見なされます。

LytA と PiaB の組み合わせは、肺炎球菌の検出に高感度かつ特異的であると記載されており、これらのアッセイセットを使用して計算された密度は一致していますが、Tavares ら 49 はその後、特異性を高めるために、推定上の転写制御遺伝子 SP2020 を LytA と組み合わせて使用​​することを推奨しています。 これら 4 つのアッセイセット (19F-非定型、19C、23A、および SP2020) はさらに検証され、94 の血清型、16 の血清群、および 59 の個別の血清型まで検出を増やすために反応セットに含められる必要があります。 大腸菌、P. jiroveci、S. agalactiae、S. pneumoniae の Xisco 遺伝子、および細菌の 16S リボソーム RNA 遺伝子を検出するためのアッセイセットは、この反応セット内では十分に最適化されていないため、次の目的でのみ使用できます。ターゲットの定性的検出。

反応セットによって一部の血清群内で単一の血清型を区別するには課題が存在します。 これらには、遺伝的に類似した血清型間の高度な交差反応性が血清型レベルでの差別を制限することが含まれます。 たとえば、血清型 7A/F と 9A/V は、同種の塩基対が連続する標的化が困難な領域 (GC 含量が低い) で 1 ヌクレオチドが遺伝的に異なるだけであり、ここで説明するすべてのハイスループット戦略ではミスプライミングが発生します2。 。 これらには、当社の均一な熱プロファイルには適合しない、より専門的な戦略が必要になります。 さらに、一部の血清型はその場で相互変換し、アセチル化の不完全な喪失または獲得により「スペクトル」上に存在する血清型 11A と 11E、15B と 15C、または 35B と 35D など、個別の血清型に臨床的に特徴付けることが容易ではない場合があります。トランスフェラーゼ50、51。 後者の 2 つの血清群は、分子的に異なる血清型を含んでいますが、臨床上の区別に問題があるため、慎重に解釈する必要があります。

この研究の他の制限には、私たちの方法には経験豊富な個人用の特殊な機器（Standard BioTools、「Fluidigm」）が必要であり、多くの設定では手頃な価格ではないことが含まれます。 ただし、この方法は他のリアルタイム qPCR プラットフォームにも簡単に適用できます。 血清型が個々の血清型に区別されていない場合、血清群内に複数の血清型が共存している場合、たとえば血清群 12A、12F と血清型 44、または血清型 7B など、グループ内で検出された血清型の細菌量が過大評価される可能性があります。 、7C および血清型 40。これらの血清型のほとんどによる定着率は私たちの設定では高くないため、これはあまり関連した影響を及ぼさないと予想されます。 これらの血清型を個別に区別することは、これらの血清型が流通している状況や、ワクチン後の時代における非ワクチン型の出現を評価する場合に重要になります。

参照される標準的な Quellung 法は、高密度で優勢なコロニー形成者の検出に限定されますが、当社の「Fluidigm」qPCR は、低密度を含む複数の同時コロニー形成を検出できます。 これは、包括的な血清型判定法 (ほとんどの血清型をカバーするアッセイセット) と、低密度定着菌を検出するための高い分析感度が含まれているためです。 qPCR のこれらの利点は、特に対象となる標準によって検出される血清型の有病率が低い場合、培養ベースの Quellung 法と比較した「Fluidigm」qPCR の診断感度と一致性が過小評価される、これらの方法の診断比較につながります。 これは実際に血清型 1 の場合に当てはまりました。 7B/C/40; 23A; 29; 33Bと35A/C/42。

私たちの研究における診断比較のさらなる制限には、複数回の凍結融解サイクルを経て約10年間保存された遡及的サンプルの使用が含まれており、これは病原体を正確に検出するあらゆる診断法の能力に影響を与える可能性があります。 Quellung 法は 2010 年 (サンプル収集直後) に実施され、「Fluidigm」qPCR では検出されなかった血清型の 9.3% がさらに検出されました。 対照的に、「Fluidigm」qPCR の分析感度と特異性は、新たに調製した培養物または gBlock キャリブレーターを使用した場合、反応セット全体で実証されました。 さらに、「Fluidigm」qPCR 反応セットは、Quellung が見逃した血清型を 39.1% 多く検出できました。 ここで、「Fluidigm」qPCR によって検出された追加の血清型の密度 (GMD) は、「Fluidigm」 qPCR と Quellung によって一致して検出された血清型の密度 (GMD) よりも約 2 倍低く、ほとんど (72.6%) は可能性が低いサブドミナント血清型でした。 Quellung 法によって検出されます。 それにもかかわらず、我々の方法は、Quellung と比較して、良好な一致性と感度で、選択された 1,973 サンプルの血清型を判定することができました。

qPCR ベースの血清型判定の使用は、血清型を割り当てるために、より大きな莢膜多糖合成遺伝子座内の短い標的配列の検出に依存しています。 血清型 14 様肺炎球菌に関する最近の記述は、短い遺伝子識別子の限界を浮き彫りにしています。 パプアニューギニアでは、急性下気道感染症で入院中の小児から分離された4つのNPS株が、qPCRによって血清型14（侵襲性VT）に割り当てられた。 これらの分離株は、Quellung、ラテックス凝集法、および PneumoCaT 法を使用すると「分類不可能」（カプセル化されていない）でした。 著者らは、部分的な遺伝的類似性にもかかわらず、異なる血清学的プロファイルと、莢膜血清型 14 に対するワクチン誘発免疫を回避する能力について説明しています。 14 様分離株のゲノム配列決定により、莢膜生合成遺伝子座を中断する変異が明らかになりましたが、血清型 14 を標的とした短い PCR 配列は無傷でした 52。 さらに、一塩基多型 (SNP) などの標的配列内の小さな変化は、標準的な qPCR 法では簡単に識別できませんが、血清型 6A および 6B53 で例示されるように、これらの単一点の遺伝的変化によって莢膜構造が変化する可能性があります。 これら 2 つの例からわかることは、場合によっては、分子血清型判定では抗原の多様性や新しい血清型を特定できない可能性があり、不一致を解決するには別の血清型判定法を使用する必要があるということです。

LytA と PiaB の両方が検出されたサンプルの 7.8% では、血清型は検出されませんでした。 私たちの方法の文脈内では、肺炎球菌と血清型の鑑別検出は、分類不可能（NT）肺炎球菌、または可能性は低いですが、反応セットに含まれていない血清型の存在を示す可能性があります。 さらに 3.8% の肺炎球菌陽性サンプルでは、​​肺炎球菌密度と総血清型密度の差がブランド アルトマン プロットの上限信頼区間を上回っていました。これは、肺炎球菌と共定着した NT 肺炎球菌を特定するのに有用な戦略である可能性があります。他の血清型。 しかしながら、Bland-Altman プロットの信頼区間を使用して共定着した NT 肺炎球菌を検出するこの方法では、低密度で存在する NT を過小評価することになります。

私たちの方法の限界には、鼻咽頭に存在する非肺炎球菌種によって獲得された莢膜血清型標的領域の検出が含まれます。 サンプルは LytA と PiaB の両方に対して陽性である必要があることを含めましたが、非肺炎球菌血清型相同体が真の肺炎球菌血清型と同時コロニー形成して存在する場合、これらは肺炎球菌血清型として割り当てられます。 この現象の例は、血清型 1 のカプセルを発現する Streptococcus mitis です 54。 コーエンカッパを使用して Quellung との qPCR 一致が不良、普通、または中程度と評価されたターゲット アッセイ セット (血清型 1、5、7A/F、11B/C、12A/F/44、23A、11B/C、29、33A) /F; 35A/C/42; 35F および 38)、これは、qPCR による追加のサンプルでこれらの血清型が検出されたためです。 共定着で検出された場合、検出されたこれらの追加の血清型が常に真の肺炎球菌である可能性を排除することはできません。 平均肺炎球菌密度と血清型密度の一致を示すブランド・アルトマンプロットでは、同時に定着した複数の血清型の総密度が総肺炎球菌密度よりも高く、下限 95% CI の範囲外である場合、これは非感染性細菌の存在を示している可能性があります。 -肺炎球菌の血清型相同体。 ここで我々は、他の非肺炎球菌連鎖球菌が検出された場合、共定着における血清型を確認するために必要に応じて追加の配列解析を行うことを提案する。

私たちの研究の大きな利点の 1 つは、定量的リアルタイム PCR 実験 (MIQE) ガイドライン 55 の出版のための最小限の情報に従ってアッセイセットごとのパフォーマンスが記述されていることと、私たちの検証に利用できる Quellung 血清型分離株のサンプルサイズが大きいことです。方法。

標準 BioTools の「Fluidigm」qPCR プラットフォーム内で反応セットをセットアップするには最初は費用がかかりますが、多くのサンプルをさまざまなサンプルに対してテストするため、データポイントの数が多いため、人件費と待ち時間が大幅に削減されるという利点があります。血清型は 1 つのプレート内で実行されます。 私たちのメソッドは比較的迅速に実行でき、180 サンプル (2 回の IFC 実行) について 92 の血清型と 15 の細菌標的の結果を 1 日以内に得ることができます。 鼻咽頭サンプルあたりのコストは約 36 米ドルで、サンプルごとに生成される包括的な血清型分析と定量的情報を考慮すると、非常に有利です。 Standard BioTools 'Fluidigm' qPCR 内の連結された反応セットは、大規模なキャリッジ研究において利点となります。 この方法は、血液、喀痰、脳脊髄液、肺炎球菌が見つかる可能性のあるその他の部位などの他の臨床検体に対してさらに検証される必要があります。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットと Stata コードは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

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私たちは、アジンコートでの最初のサンプル収集を促進した南アフリカ医学研究評議会/ウィッツ地方公衆衛生および健康移行研究ユニット (アジンコート) に感謝したいと思います。 同様に、私たちはクリス ハニ バラグワナス学術病院の HIV クリニックとソウェトのベビー ウェルネス クリニックのスタッフに感謝します。 我々は、文化に基づいたクエルング血清型検査が最初に行われた南アフリカの国立感染症研究所を認めます。 また、サンプルを提供していただいた Agincourt および Soweto 登録の参加者全員に感謝します。

この研究は、ビル & メリンダ ゲイツ財団 [助成金番号: OPP1189378] によって支援されました。 科学技術省および国立研究財団、ワクチン予防可能な疾患における南アフリカ研究委員長イニシアチブから部分的な支援がありました。 南アフリカ医学研究評議会。 資金提供者は、研究の設計、データの収集と分析、出版の決定、原稿の準備には何の役割もありませんでした。

南アフリカ医学研究評議会、ワクチンおよび感染症分析研究ユニット、ウィットウォータースランド大学健康科学部病理学部、ヨハネスブルグ、南アフリカ

サラ・L・ダウンズ、シャビール。 A. マディ、メルウェ族のララ、マーサ。 C. ヌネス & コートニー P. オルワーゲン

科学技術局/国立研究財団、南アフリカ、ウィットウォータースランド大学保健科学部ワクチン予防可能な疾患研究委員長イニシアチブ、ヨハネスブルグ、南アフリカ

サラ・L・ダウンズ、シャビール。 A. マディ、メルウェ族のララ、マーサ。 C. ヌネス & コートニー P. オルワーゲン

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SLD、SAM、MCN、および CPO は研究を概念化し、設計し、資金を獲得しました。 SLD は反応セットの設計を担当し、SLD と CPO は gBlock の設計を担当しました。 SLD と LvdM は実験と qPCR 分析を実行しました。 SLD は統計分析を実行しました。 SLD が最初の原稿を執筆し、すべての著者が最終原稿をレビュー、寄稿、承認しました。

サラ・L・ダウンズまたはコートニー・P・オルワーゲンとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

SL、Downs、SA、Madhi、van der Merwe、L. 他 15 種類の細菌種と 92 種類の肺炎球菌血清型を検出および定量するためのハイスループット ナノ流体リアルタイム PCR の最適化。 Sci Rep 13、4588 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-31820-4

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受信日: 2022 年 12 月 2 日

受理日: 2023 年 3 月 17 日

公開日: 2023 年 3 月 21 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31820-4

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