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Nature Communications volume 14、記事番号: 2824 (2023) この記事を引用

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11 オルトメトリック

メトリクスの詳細

自然の対立遺伝子変異が量的発生システムの変異をどのように説明するかを研究するために、我々は、2 つの Caenorhabditis elegans 分離株間の生殖幹細胞ニッチ活性の自然な差異を特徴付けました (前駆体ゾーン (PZ) サイズとして測定)。連鎖マッピングにより、染色体 II および V 上の候補遺伝子座が得られ、PZ サイズが小さい分離株では、生殖幹細胞の運命を促進する中心的なシグナルである Notch リガンド、lag-2/Delta に 148 bp プロモーターの欠失が存在することがわかりました。予想どおり、大きな PZ を持つ分離株にこの欠失を導入すると、PZ サイズが小さくなりました。予想外なことに、より小さい PZ を持つ分離株で欠失した祖先配列を復元すると、PZ サイズは増加せず、むしろさらに減少しました。これらの一見矛盾した表現型効果は、lag-2/Delta プロモーター、染色体 II 遺伝子座、および追加の背景遺伝子座の間のエピスタティックな相互作用によって説明されます。これらの結果は、動物幹細胞システムを制御する定量的遺伝子構造についての最初の洞察を提供します。

細胞増殖の微調整は生物の発生と組織の恒常性の基本的な側面であり、幹細胞のニッチによって調整されることがよくあります。幹細胞ニッチ活性の小さな混乱でも、組織の成長と維持の調節が解除され、病状を引き起こす可能性があります1。したがって、幹細胞ニッチの活性を調節する分子遺伝学的機構を解明することが生物学研究の主要な焦点となっている。動物における幹細胞ニッチ機能の発生遺伝学的研究により、根底にある重要な分子調節機構が解明されているが、幹細胞システムの活性が自然集団内に分離する遺伝的変異によって調節されるかどうか、またどのように調節されるかについては、ほとんど対処されていないままである。存在する場合、そのような対立遺伝子の変異は幹細胞ニッチ活性の変異にどのように寄与するのでしょうか? 幹細胞ニッチシグナル伝達に関与する既知の遺伝子にはこの変異が隠されているのでしょうか? そして、幹細胞ニッチ活性の自然変動は、効果の大きい単一の遺伝的変異の影響と効果の小さい変異の多遺伝子の寄与によってどの程度説明できるのでしょうか? ほとんどの量的形質は複雑で、多遺伝子構造が関与しており、遺伝的変異は相加的に作用するだけでなく相互作用的に作用します。このようなエピスタシスは、遺伝子間 (G x G) 相互作用とも呼ばれ、異なるゲノム遺伝子座の対立遺伝子変異体間の非相加的相互作用に対応します 2。強力な多遺伝子性とエピスタシスは、多様な分類群にわたるほとんどの量的表現型で観察されています 3、4、5、6、7、8 が、3 つ以上の遺伝子座が相互作用する高次のエピスタシスを含む、複雑なエピスタシス相互作用の詳細なメカニズムの分析は依然としてまれです 9,10 、11、12、13、14、15。実験的に特性を明らかにすることは困難ですが、分子および定量的遺伝分析は、広範なエピスタティック相互作用が発生表現型の根底にあることも示唆しています15、16、17、18、19、20、21、22、23、24。しかし、これまでのところ、天然の対立遺伝子間の相互作用が動物幹細胞系の量的変動をどのように引き起こすかについての情報はありません。

生殖系列幹細胞（GSC）システムは後生動物の発生と生殖の基礎であり、不死の生殖細胞集団を未分化状態に維持し、遺伝的手がかりと環境的手がかりを統合して生殖細胞前駆細胞の生産を調整します1,25,26。遺伝子研究と evo-devo 比較研究により、遠方の分類群にわたる GSC システムの多様性が明らかになりました 27,28,29 が、これらのシステムの活動が同じ種の自然集団において量的な変動を示すかどうかは、現時点では不明です。密接に関連した種（例えば、ショウジョウバエ属または線虫属 Caenorhabditis 内）のゲノムおよび発生遺伝学的分析は、GSC ニッチの主要な分子シグナル伝達経路や細胞間相互作用などの主要な特徴が属内で大部分保存されていることを示しています。 31、32、33、34。それにもかかわらず、ショウジョウバエの集団遺伝学的研究は、中央の GSC 遺伝子が種内であっても驚くほど高レベルの対立遺伝子変異を保持している可能性があることを示しており、これらの遺伝子が急速に、そして多くの場合正の選択によって進化することを示唆しています 35,36,37。したがって、基本的な発生プロセスにおけるそれらの重要性にもかかわらず、GSCニッチの調節遺伝子は進化的に制約されていないように思われる。不明な点は、観察された自然な対立遺伝子の変異が、GSC ニッチ活性などの表現型の変異にどのように変換されるのかということです。

GSC ニッチ活性における自然な量的変動の遺伝的基盤を研究するために、我々は C. elegans の GSC システムを使用します。これは、明確に定義された一連の分子シグナル伝達経路を含む、幹細胞ニッチ機能を研究するための単純な in vivo システムとして機能しています25。、38、39。 C.エレガンスの雌雄同体の生殖系列は、幹細胞と有糸分裂および減数分裂S期の前駆細胞を含む、有糸分裂ゾーンまたは増殖ゾーンとも呼ばれる遠位生殖細胞前駆ゾーン（PZ）を備えた2つの対称アームで構成されています（図1a）。。生殖細胞は、腕の近位端に向かって進行するにつれて、減数分裂段階を経て配偶子前駆体に分化します (図 1a、b)25,38。重要な調節シグナルは、PZ内の細胞を覆い、細胞と接触する体性生殖腺細胞である遠位先端細胞（DTC）によって発現されます（図1a）。これらのシグナルは、Delta/Serrate/LAG-2 (DSL ファミリー) リガンド、LAG-2 および APX-1 であり、遠位生殖細胞の Notch (GLP-1) 受容体を活性化し、幹細胞の運命を促進し、減数分裂への移行を阻害します 40 、41、42、43、44、45、46。したがって、DTC は幹細胞ニッチを構成します 25。 GLP-1/Notch シグナル伝達は生殖幹細胞プールの維持に必要かつ十分です 25,39。生殖細胞は、近位に移動して DTC との接触を失うにつれて、徐々に減数分裂に入ります。これは、GLP-1/Notchの下流で自己複製を促進するPUF（プミリオおよびFBF）RNA結合タンパク質やその他のRNA調節タンパク質（GLD-1、GLD-2、SCFPROM-1）を含むRNA調節タンパク質のネットワークによって制御されています。）減数分裂への移行を促進します25、38、39、47、48、49。生殖腺鞘細胞からの追加シグナルは、線虫の生殖細胞の増殖と分化をさらに調節します50、51、52、53、54、55、56。したがって、生殖系列 PZ 細胞の数は、遠位の増殖活性と近位の減数分裂状態への時空間的移行の相互作用によって決定されます。さらに、C.エレガンスの生殖細胞系の増殖活性は、生理機能や外部環境の変化に非常に敏感で、栄養素の質と量、温度、社会環境に応じて異なります25、32、57、58、59、60、61。環境変動は、代謝および感覚シグナル伝達経路（TGF-β、TOR、AMPK、インスリンなど）を介して GSC 増殖を調節します。これらの経路は、ニッチ媒介デルタ / ノッチシグナル伝達に依存または独立して作用します 62,63,64,65,66,67。 68. したがって、線虫の生殖幹細胞システムは可塑性が高く、環境の微妙な変化に応じてその活性を微調整することができます。自然の遺伝的変異がこの幹細胞系の活性を同様に調節できるかどうかは不明です。しかし、以前の報告では、生殖系列前駆細胞プールのサイズは、異なる Caenorhabditis 種間だけでなく、異なる C. elegans 野生分離株間でも異なることが示唆されています 32,69。

a 各生殖腺腕の遠位端に位置する生殖系列前駆領域 (PZ) には、有糸分裂中の幹細胞と前駆細胞が含まれています。生殖幹細胞 (GSC) プールは、遠位 PZ 細胞を包み込む体細胞遠位先端細胞 (DTC) によるデルタ/ノッチシグナル伝達を通じて維持されます。 Delta/Serrate/LAG-2 (DSL ファミリー) リガンドである LAG-2 および APX-1 は、生殖細胞の Notch (GLP-1) を活性化して増殖を促進すると同時に、減数分裂への進入を防ぎます。生殖細胞は、アームの近位端に向かって進むにつれて、減数分裂段階を経て配偶子前駆体に分化します。 b PZ サイズは、PZ セル数の代用として使用されました。 DAPI で染色されたホールマウント線虫を落射蛍光下で画像化しました。 PZ 境界 (点線) は、生殖細胞の核の形状に基づいて前述のように特定されました 38。 b' PZ 領域は、ImageJ 内の他の組織から手動で切り取られました。 b" 蛍光閾値を使用して、PZ 領域をバックグラウンドからセグメント化しました。PZ 領域はピクセル単位で測定しました。スケールバーは 20μm。c この方法で測定された PZ 領域 (PZ サイズにスケール - μm2/1000) は、手で数えた PZ とよく相関します。細胞数データは、成人の 2 つの段階（L4 中期 + 24 時間および若年成人 + 24 時間）における 2 つの分離株 JU1200 および JU751 の測定から得られました。各データポイントは個人を表します（線形モデル adj R2 = 0.758、p < 2.2 E-16、n = 87); 実験は 2 回繰り返され、同様の結果が得られた d. C. elegans および C. briggsae の選択された野生分離株の若年雌雄同体 (子宮内卵 1 ～ 10 個) における PZ サイズ (μm2/1000) . クロスバーとエラーバーは、一般化線形モデルから導出された推定周辺平均 ± 標準誤差を表します。小文字は有意を示します (p < 0.05) Tukey で調整されたペアワイズコントラスト: 同じ文字を共有する分離株は PZ サイズに有意な差を示さない. 2 つのブロックにわたる n 値が x 軸の上に示されています。 e 検査された野生分離株の地理的起源。 R パッケージ rnaturalearth および rnaturalearthdata v. 0.1.0112 および rgeos v. 0.5-9113 を使用して作成されたマップ。データと統計結果については、補足ノート 1 および 2、およびソースデータファイルを参照してください。

この研究では、C.エレガンスの生殖幹細胞ニッチ活性の自然変動を定量化し、遺伝学的に特徴付けることを目的としました。われわれは、生殖系列前駆体ゾーン（PZ）のサイズ（ここでは生殖幹細胞ニッチ活性の代用）が、同一の標準的な実験室条件下で遺伝的および地理的に異なる野生分離株間で異なることを示す。私たちは連鎖マッピングアプローチを使用して、PZ サイズの顕著な違いを持つ 2 つの野生分離株に焦点を当て、PZ サイズの自然変動に関連するゲノム領域を特定しました。遺伝子マッピングにより、染色体 II および V 上の 2 つの大きな影響を与える遺伝子座を含む 4 つの QTL 候補が明らかになりました。これらの遺伝子座は、マッピングパネルの系統間の PZ サイズの変動の約 32% を説明するために相加的に作用します。我々は、染色体 V 上の QTL 領域の DSL リガンド lag-2 のプロモーター領域に INDEL 変異体が存在し、これが PZ サイズの変動の原因となることを発見しました。しかし、我々は、この変異体の表現型への影響が、第 II 染色体および追加の未知のゲノム遺伝子座上の QTL とのエピスタティックな相互作用を通じて強く調節されていることも発見しました。まとめると、我々の結果は、複雑なエピスタティック相互作用が生殖幹細胞ニッチ活性の自然変動の重要な寄与因子であることを示し、動物幹細胞系の定量的遺伝構造についての最初の洞察を提供する。

標準的な実験室条件下では、参照野生型 C. エレガンス株 (N2) の雌雄同体生殖系列前駆細胞ゾーン (PZ) には、通常、成体初期には約 250 個の細胞が含まれます 25。 PZ 全体を画像化して生殖細胞の総数をカウントすることは、多数の菌株をスクリーニングするには時間がかかり、非効率的です。 Caenorhabditisの複数の野生分離株間のPZサイズの自然な違いを定量化するために、我々はまず、ホールマウントDAPI染色生殖腺の単一蛍光画像におけるPZの断面積を定量化することによってPZサイズを近似する方法を開発した（図1）。 1b)。この方法によって得られたPZ測定値は、PZ全体にわたる画像スタックからのPZ核の個々の数とよく相関していました（調整R2 = 0.758、p < 2.2E-16）（図1c、補足注1）。私たちは世界中からのC. elegansとC. briggsaeのいくつかの野生分離株を調べ、標準的な実験室条件で測定した場合、PZサイズに種間および種内の有意な変動があることを発見しました（図1d、補足注2）。データセットにおける若年成人の PZ サイズの広義の遺伝率は 28% と推定されました (補足注 2d)。

調査された野生分離株の中で、JU1200 (スコットランド) と JU751 (フランス) は、再現性の高い有意な差異を示しました。 JU1200 は、実験室参照株 N270 と高い遺伝的類似性を示します。若い成体の雌雄同体として、JU1200はJU751よりも一貫してより多くの前駆細胞を示しました（図1d）。我々は、幼虫後期から生殖成体段階まで、これら 2 つの分離株の PZ 細胞数をアッセイしました。 PZ細胞数はL4中期段階では差がありませんでしたが、JU751は成体早期の2つの段階にわたってJU1200と比較してPZ細胞数の大幅な減少を示しました（図2a、補足注3）。

a 4 つの発達段階における PZ 核の数: L4 中期幼虫 (mL4)、子宮内に 1 ～ 10 個の卵を持つ若年成虫 (YA)、L4 中期から 24 時間後の成虫 (mL4 + 24 時間)、および 24 歳の成虫若年成人後の時間 (YA + 24 時間)。押し出された DAPI 染色生殖腺の Z スタックで核をカウントしました。小文字は、Tukey で調整されたペアワイズコントラストが有意であることを示します (p < 0.05)。そのため、同じ文字を共有するグループは大きく異なりません。クロスバーとエラーバーは、一般化線形モデルから導出された推定周辺平均値 ± 標準誤差を表します。各株およびステージの n 値は x 軸の下に示されています (JU1200=赤、JU751=青)。 b L4 ステージ中期での EdU の 15 分間パルス後の PZ 内の EdU+ (陽性) 核の数 ( ***p = 0.00005、Tukey で調整されたペアワイズコントラスト)。 n 値は x 軸の下に示されています。クロスバーとエラーバーは、一般化線形モデルから導出された推定周辺平均値 ± 標準誤差を表します。 c mL4 + 24時間のホールマウントDAPI染色ワームのPZの代表的な画像。スケールバー: 20μm。 d L4中期段階でのEdU染色の代表的な画像。点線は PZ の近位境界を示します。スケールバー: 20μm。データは 1 つの (2 つのうちの) 実験ブロックからのものを示しています。データおよび統計結果については、補足ノート 3 および 4、およびソースデータファイルを参照してください。

PZ サイズは増殖活性だけでなく、減数分裂運命への移行速度にも影響される可能性があることを考慮して、15 分間の EdU (5-エチニル-2-デオキシウリジン) パルスを使用して有糸分裂活性をアッセイし、細胞内の増殖を直接標識して定量しました。成人期の前のPZ。 JU751とJU1200のPZ細胞数に大きな差がなかったL4中期では（図2a）、JU751はEdU陽性細胞数の大幅な減少を示し、したがってJU1200よりも低い生殖細胞増殖活性を示しました（図2b、補足4)。したがって、生殖細胞増殖の違いが、JU751 と JU1200 の間で観察される PZ サイズの違いに寄与します。

JU751とJU1200の間で観察されたPZサイズの違いの根底にある遺伝的構造を特徴付けるために、これら2つの分離株に由来する既存のF2組換え近交系（RIL）を使用して、定量的形質遺伝子座（QTL）連鎖マッピングを実行しました（図3a、b）71。 RILは、親の相互交雑からF1雌雄同体を自家受粉させ、F2系統を12世代にわたって近親交配して、2つの親遺伝子型のうちの1つについて各遺伝子座でホモ接合性の系統のパネルを作製することによって構築されました（図3b）71。 70個のRILで若い成体の雌雄同体（子宮内に卵1〜10個）のPZサイズを測定し、ゲノム全体の140個のSNPマーカーの組換え頻度に由来する遺伝地図に表現型の違いをマッピングしました（図3a、補足図1）。）。 PZのサイズはRIL間で連続的に変化し、進行性の分離（つまり、親の表現型を超える極端な表現型）を示しました（図3a）。したがって、R パッケージ R/qtl72 を使用したマルチ QTL モデリングアプローチを採用しました。最初のステップとして、単一遺伝子座の遺伝子型が表現型データを説明できる可能性を計算するアルゴリズムである単一 QTL スキャンを実行しました。このスキャンにより、染色体 II (QII) の中心にある 1.5-LOD 間隔が約 7.25 Mb である大きな影響遺伝子座が明らかになりました (図 3c、緑色の線)。次に、2-QTL アルゴリズムを使用して、遺伝子座のペアが表現型に関連する可能性を決定しました。重要なのは、このアルゴリズムでは遺伝子座が相反する効果を持つことを許可していないことです。 2QTLスキャンにより、染色体II上のQII QTLと相加的に作用する染色体Vの左腕上の追加の遺伝子座（QV）（約2.6 Mb）が明らかになりました（図3d–f）。相加的共変量としてQII QTLを用いた単一QTLマッピングにより、染色体V上のQV QTLも明らかになりました（図3c、マゼンタ線）。追加の2QTLスキャンにより、特に反対の効果を持つ遺伝子座間の相互作用を考慮して、染色体I（QI、〜1 Mb）およびX染色体（QX、〜2.7 Mb）上のさらに2つの潜在的なQTLが明らかになりました（図3g–i）。次に、これら 4 つの遺伝子座を候補として使用して、マルチ QTL モデルの選択を実行しました。モデルの選択は手動で実行し、R/qtl で提供されるモデル構築および枝刈りツールも使用しました。このアルゴリズムは単純に、または指定されたモデルから始まり、連続するゲノムスキャンを通じて遺伝子座を追加し、各モデルにペナルティ付き LOD スコアを割り当てます。次に、モデルを枝刈りして、ペナルティが最も高い LOD スコアを持つ最も単純な形式を実現します (LOD > 0 は、モデルが QTL がゼロのモデルよりも優れたパフォーマンスを示すことを示します)。テストされたすべてのモデルの代表的なセットと、ペナルティが課された LOD スコアを図 3j に示します。私たちは両方のアプローチを使用し、RIL データが QII と QV が加算的に作用して PZ サイズを決定するモデルを最もよくサポートしていると判断しました。このモデルは、RIL データの表現型の変動の約 32% を説明しました (補足注 6)。

a F2 RIL（n = 70、6つの実験ブロックにわたってアッセイ）および親系統、JU1200（赤）、およびJU751（青）におけるPZサイズ推定値（補正）（詳細は補足注5を参照）。 b F2 RIL の生成と分析。点線: 仮想の QTL。 c シングル QTL スキャンは 2 つの QTL (QII および QV) を識別します。水平線: 順列テストに基づく LOD しきい値。 x 軸: 各染色体の遺伝地図。緑の線: ナイーブなスキャン結果。マゼンタの線: マーカー M13 (ピーク、マゼンタの曲線) が共変量として含まれるスキャンの結果。 d Two-QTL スキャンの結果。上半分: 加法モデルとヌルモデルを比較する LOD スコア (LODa)。下半分: 相加性と単一 QTL モデル (LODav1) を比較した LOD スコア。閾値を超える LODav1 スコア (白色、順列テストによって決定) は、単一 QTL モデルよりも適合性が向上していることを示します。 e パネル D の下半分のピークにおけるマーカーの相互作用プロット (chr V、M1; chr II、M14)。 f II および V の QTL のおおよその位置とサイズ。 g 相反する効果を可能にする 2 つの QTL スキャン。上半分: 完全な 2 QTL モデルと相加的モデルを比較した LOD スコア (LODi)。下半分: 完全なモデル (相互作用を考慮) と単一 QTL モデル (LODfv1) を比較した LOD スコア。閾値を超える LODi スコア (白) は相互作用の証拠を示し、閾値を超える LODfv1 スコアは単一 QTL モデルよりも適合度が向上していることを示します。 h パネル G の上半分の重要なピークのマーカーの相互作用プロット (chr I、M14 および chr X、M2)。 i 染色体 I および X 上の候補 QTL のおおよその位置とサイズ。 j マルチ QTL モデル選択の表現。ノードは候補 QTL (QII = chrII@35 cM、QV = chr V@0 cM、QI = chrI@23 cM、QXa = chrX@16 cM、QXb = [email protected] cM) を表し、スポークは相互作用を表します。ゼロを超えるペナルティ付き LOD スコア (各モデルの下) は、グローバルヌル (QTL ゼロ) よりも優れたパフォーマンスを示します。詳細については、「方法」、補足図 1、および補足注記 6 を参照してください。パネル a、e、および h の Y 軸は、μm2/1000 (0.1008 μm2/ピクセル) にスケールされています。データはソースデータファイルとして提供されます。

PZ サイズに対する染色体 II QTL (QII) の影響を検証するために、ほぼ同質遺伝子系統 (NIL) を生成しました。 QIIにJU751配列を含む2つのRILを10世代かけてJU1200に戻し交雑し、QTLのさまざまなセグメントにJU1200配列を含む2つのNILを生成しました（図4a）。 QIIにJU1200配列を含む2つのRILを10世代かけてJU751に戻し交雑し、QTLのさまざまなセグメントにJU1200配列を含む5つのNILを生成しました（図4b）。 NIL は、QTL 領域内の親特異的な PCR 産物の存在を選択することによって生成されました。各 NIL で PZ サイズを数回分析しました。 JU1200 バックグラウンドで確立された NIL は、PZ サイズに微妙な影響を示しましたが、これは実験アッセイ (ブロック) 全体で必ずしも一貫しているわけではありませんでした。したがって、実験ブロック効果を説明するために一般化線形モデルを使用して9つのブロックから得られた集計結果を分析し、小さいながらも大幅なPZサイズの減少を検出できることがわかりました（図4c、補足注7）。 JU751 バックグラウンドの NIL は、PZ サイズのより大きくより一貫した差異を示し、PZ サイズに対する QII の影響を確認しました（図 4d、補足注 8）。さらに、戻し交雑手順中に発生した組換えイベントにより、QTL領域を7.25 Mbから2.04 Mbに絞り込むことができました（図4b）。この減少したゲノム領域で JU751-JU1200 多型を検索すると、合計約 1024 個の変異体が明らかになりました (196 個の潜在的な影響の大きい変異体、つまり、フレームシフトやナンセンス変異などにより遺伝子機能が変化する可能性が高いと BCSQ アルゴリズムによって予測された変異体を含む) 250 個の異なる遺伝子と 10 個の大きな INDEL に含まれます70 (詳細についてはソースデータを参照)。ただし、さらなる分析のための強力な候補バリアントは特定されませんでした。

a JU1200 バックグラウンドでの近同質遺伝子系統 (NIL) の生成。 II 染色体上の約 7.25 Mb の元の QII QTL 間隔を示す図。縦の破線は LOD ピークのおおよその位置を示します。 QII に JU751 配列を含む 2 つの RIL、RIL54 (株 NIC654) および RIL127 (株 NIC727) を 10 世代かけて JU1200 に戻し交配し、2 つの NIL (株 NIC1697 および NIC1701) を生成しました。青: JU751 遺伝子型、赤: JU1200 遺伝子型。 b JU751 バックグラウンドでの NIL の生成。染色体 II 上の約 7.25 Mb の元の QII 間隔を示す図。縦の破線は元の QTL の LOD ピークのおおよその位置を示します。 QII に JU1200 配列を含む 2 つの RIL、RIL128 (NIC728 株) および RIL71 (NIC671 株) を 10 世代かけて JU751 に戻し交雑し、5 つの NIL (株 NIC1671、NIC1672、NIC1673、NIC1675、および NIC1676) を生成しました。青: JU751 遺伝子型、赤: JU1200 遺伝子型。 c パネルaに示すJU1200バックグラウンドおよび親分離株で確立されたNILのPZサイズ測定。 n 値は x 軸の上に表示されます。 9 つの実験ブロックからのデータが分析されました。 d パネルbに示すJU751バックグラウンドおよび親分離株で確立されたNILにおけるPZサイズ測定。 n 値は x 軸の上に表示されます。データは単一（9 つのうち）の実験ブロックからのものを示しています。減少した QII 間隔は、各 NIL が JU751 と比較して PZ サイズの有意な増加を示すかどうかを尋ねることによって決定されました。 NIC1676 を除くすべての NIL には、JU751 よりも大きな PZ がありました。したがって、これらの NIL の JU1200 セグメントが重複する領域は、短縮された QTL 間隔 (2.04 Mb) と考えられました。パネル c および d に示すデータの分析は、生データ (ピクセル単位の PZ エリア) に対して実行され、y 軸は表示のために μm2/1000 にスケーリングされました (0.0504 μm2/ピクセル)。クロスバーとエラーバーは、一般化線形モデルから導出された推定周辺平均値 ± 標準誤差を表します。 p 値は、Tukey で調整されたペアワイズコントラストから導出されます。データおよび統計結果については、補足ノート 7 および 8 およびソースデータファイルを参照してください。

QV の 2.6 Mb 領域には、JU751 と JU1200 の間の PZ サイズの違いに寄与する推定候補バリアント (SNP および INDELS) が 21 個だけ含まれていました。これらの変異体を詳細に検査すると、主要な候補の 1 つが明らかになりました。それは、Notch 経路における生殖細胞の増殖と分化の主要な制御因子であるデルタ様リガンド、lag-2 をコードするゲノム領域の上流にある JU751 の欠失です 25,70。この欠失を lag-2(cgb1007) と名付けました。この欠失のある遺伝子型はこれ以降、lag-2p(-) と省略されますが、この欠失のない遺伝子型は lag-2p(+) と呼ばれます。この欠失は148 bpに及び、転写開始部位の2,441 bp上流のlag-2プロモーター領域に位置しています（図5aおよび補足図2）。 lag-2 の 3.3 kb 上流プロモーター領域には、DTC における強力な lag-2 転写に必要な 6 つの HLH-2 結合部位 (E-box) が含まれています30,73。 lag-2（cgb1007）欠失には、これらの保存されたHLH-2結合部位の1つと、30 bpのポリ（G）リピートの大部分が含まれています（図5a、補足図2および3）。この欠失は、転写因子HLH-273の特異的結合部位の喪失によるlag-2転写の減少によるJU751で観察される生殖細胞増殖の減少を説明できる可能性がある。

QV QTL (黒いバー) と、lag-2 遺伝子とその 3 kb 上流配列を含むその中の 5 kb 領域の図。十分に特徴付けられているlag-2プロモーターには、6つのHLH-2 Eボックス（濃青色）を含むいくつかの既知の転写因子結合部位が含まれています115。 JU751 には、3 番目の HLH-2 結合部位と重なる 148 bp の欠失 (赤色) と、30 bp のポリ G リピート (オレンジ) の大部分があります。すべてのプロモーター要素の場所と UCSC phastCons 統計 (緑色) は、wormbase.org (バージョン WS283) JBrowse ツール 115 から取得されました。 b 若年成人段階での親および対立遺伝子置換系統（ARL）の PZ のサイズ（μm2/1000）。クロスバーとエラーバーは、一般化線形モデルからの推定周辺平均 ± 標準誤差を表します。 2 つのブロックにわたる n 値が x 軸の上に表示されます。解析は生データ (ピクセル単位の PZ エリア) に対して実行され、y 軸は表示のために μm2/1000 にスケール化されました (0.0504 μm2/ピクセル)。 c L3中期のDTCにおけるlag-2転写物のsmFISH定量化に使用される代表的な画像（lag-2 mRNA緑色、DAPI [DNA]白色、スケールバー10μm）。生殖腺腕の輪郭は破線で示されています。矢印は DTC を示します。 c' cのDTC領域の拡大図。矢印は DTC を示します。矢印は、lag-2 発現レベルを決定するために定量化された個々の点を示します。 d – f smFISHによるlag-2 mRNA点の定量。クロスバーとエラーバーは、単一の一般化線形モデルからの推定周辺平均 ± 標準誤差を表します。すべての遺伝子型について、ステージあたり n = 19 または 20。わかりやすくするために、1 つの実験からのデータを 3 つのグラフに分割しました。異なる小文字を持つグループは、Tukey で調整されたペアワイズコントラストに従って有意に異なります (p < 0.05)。データおよび統計結果については、補足ノート 9 および 10 およびソースデータファイルを参照してください。

1500を超えるC.エレガンスの野生分離株70,74のグローバルパネルの全ゲノム配列データを検査したところ、lag-2(cgb1007)欠失が分離株JU751に特有であることが判明した。 lag-2 プロモーター領域の同様だがより大きな欠失が、アジアからの 2 つの分離株、GXW1 および JU4073 で見つかりました（補足図 3c、d）。他に lag-2(cgb1007) 欠失を有する分離株は見つからなかったため、この欠失が分離後の実験室培養中に生じた可能性があるのではないかと考えました。したがって、我々は、2004 年と 2005 年に JU751 と同じ生息地 (堆肥) および場所 (フランス、ル・ペルー・シュル・マルヌ) から収集された追加の分離株 (全ゲノム配列データが存在しない) を調べました75。同日にこの産地から JU751 とともに収集された (n = 5) は、非常に類似したハプロタイプを共有し、lag-2(cgb1007) 欠失も保有していました。対照的に、2004 年と 2005 年の他の時期に収集された、異なるハプロタイプを持つ検査されたすべての分離株 (n = 13) には欠失がありませんでした 71 (補足図 3)。我々は、lag-2(cgb1007) 欠失は実験室での単離前に獲得されたものであり、この対立遺伝子は自然集団ではおそらくまれであると結論付けています。

lag-2(cgb1007) ゲノム領域が JU751 と JU1200 の間の生殖系列 PZ サイズの違いに寄与していることを検証するために、CRISPR-Cas9 ゲノム編集を使用して相互対立遺伝子置換系統 (ARL) を作成しました。まず、JU1200 に lag-2(cgb1007) 欠失を導入し、JU1200lag-2p(-) 株を作成しました。次に、JU751 の欠失した lag-2 プロモーター領域を復元し、JU751lag-2p(+) 株を作成しました。予想どおり、JU1200 バックグラウンドの 148 bp フラグメントを除去すると、PZ サイズが大幅に減少しました (図 5b)。対照的に、そして予想に反して、JU751バックグラウンドで対応するフラグメントを復元すると、PZサイズは増加しませんでしたが、さらに減少しました（図5b、補足注9）。 lag-2(cgb1007) 欠失は、JU1200 バックグラウンドに導入された場合、JU751 と同程度に PZ サイズを減少させるのに十分ですが、JU751 と JU1200 の間で観察される PZ サイズの違いに寄与する唯一の遺伝的変異体ではありません。言い換えれば、lag-2(cgb1007) 欠失の影響は遺伝的背景に強く依存します。これは、QV QTLの限界効果がQII QTLでの変動を考慮した場合にのみ検出可能であったという我々のQTL分析と一致しています（図3c）。さらに、lag-2(cgb1007) は PZ サイズに明らかな影響を及ぼし、したがって QV の全体的な影響に寄与しますが、QV QTL 領域内の他の原因となる変異を除外することはできません。

上記の結果を考慮して、次に、観察された PZ サイズの遺伝子型の違いが、lag-2 発現の違いによって説明できるかどうか、またどのように説明できるかを直接判断したいと考えました。単一分子蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (smFISH) 76,77 を使用して、親分離株および相互 ARL、JU1200lag-2p(-) および JU751lag-2p(+) の DTC における lag-2 転写物を定量しました。まず親分離株のlag-2発現を測定したところ、成体期よりも幼虫の発育中の発現がかなり高く、L3初期段階で最も強い発現が見られた（補足図4、補足注記12）。 3つの幼虫段階にわたる親分離株および相互ARLにおけるlag-2発現を定量化したところ、L3初期（ただしL2中期またはL4中期ではない）でJU1200がJU751と比較して有意に高いlag-2発現を示したことが判明した（図 5d、補足注 10)、より大きな PZ サイズと一致しています。注目すべきことに、L3段階のJU1200における比較的高いlag-2の発現は、JU1200lag-2p（-）では完全に廃止され、3つの発達段階すべてにわたってJU751と非常に類似した発現レベルを示しました（図5e、補足注10）。これらの結果は、L3 段階での強力な lag-2::GFP 導入遺伝子発現には、lag-2 プロモーター E-ボックスが必要であることを示す過去の結果と一致しています 73。 148 bpのlag-2プロモーター配列をJU751バックグラウンドに挿入しても、JU751と比較してL3でのより高いlag-2発現は生じませんでした。代わりに、JU751lag-2p（+）のlag-2発現はL3で低くなり、段階間の発現変化の傾向は同様でした（図5f、補足注10）。この結果は、JU751lag-2p(+) の PZ サイズの予期せぬ減少が実際に、lag-2 発現の減少と因果関係があることを確認しました。全体として、これらの smFISH 測定は、lag-2 発現 (L3 段階での) が、成体初期段階で観察された PZ サイズの表現型の違いを厳密に再現していることを示し、lag-2(cgb1007) 欠失の影響が遺伝的影響に強く依存していることを裏付けています。背景。親分離株の分析では、C.エレガンスの生殖幹細胞ニッチ活性の自然な違いが、コアシグナル伝達成分であるNotchリガンドlag-2の発現の違いに直接関係している可能性があることも示している。

lag-2 プロモーター変異体と遺伝的背景との間の明らかなエピスタティックな相互作用を考慮して、我々は、1) NIL (略称) で分離された染色体 II QTL の中央部分間の追加の 2 方向および 3 方向相互作用を説明するために、より網羅的なモデルを構築しました。完全な QII QTL（遺伝子型 C2-JU1200 または C2-JU751）と区別するための C2）、2）lag-2 プロモーターバリアント（遺伝子型 lag-2p(+) または lag-2p(-) の略称 C5）、 3) 遺伝的背景 (BGND—JU1200 または JU751)。これを行うために、8 つの可能な遺伝子型の組み合わせ (i から viii とラベル付け) をすべて含む大規模なデータセットを生成しました (図 6a)。このデータセットを分析すると、微妙かつ劇的な二方向および三方向の相互作用が明らかになりました (図 6b–e)。これらのデータを詳細に調査するために、ベイズ情報量基準 (BIC) とモデル (D2) で考慮される調整逸脱度を最適化するトップダウンのモデル選択戦略を使用して、一般化線形モデルを構築しました 78 (補足ノート 11)。最適化されたモデルは、PZ サイズが 3 つの主効果すべてとそのすべての相互作用 (つまり、完全に交差) によって最もよく説明されることを示しました。さらに、このモデルには、異なる実験ブロック間の変動を考慮した固定メインブロック効果と相互作用が含まれています。このモデルは、調整された逸脱度 (D2) の 33.4% を占め、データによく適合します (残留逸脱度 = 2763 df で 2796.5; Pχ2 = 0.324) (補足ノート 11)。

相互作用分析で使用される 8 つの遺伝子型の生成を示すスキーム。異なる遺伝子型は、JU1200 および JU751 バックグラウンド NIL の lag-2(cgb1007) 欠失を作成または置換することによって得られました。次に、改変に成功した系統を親系統に戻し交雑して、親の背景における CRISPR 改変を単離しました。わかりやすくするために、遺伝子型には i ～ viii のラベルが付けられています。 b 8 つの遺伝子型すべてを含むデータセットを記述する一般化線形モデルからの PZ サイズの推定周辺平均 ± 標準誤差。 JU1200 および JU751 遺伝子型はそれぞれ赤と青で示され、チャートの下の遺伝子座および背景ごとに示されています。クロスバーとエラーバーは、一般化線形モデル (両側) からの推定周辺平均 ± 標準誤差を表します。小文字は、同じ文字を共有するグループが有意に異ならないように、Tukey で調整されたペアワイズコントラストが有意 (p < 0.05) であることを示します。各遺伝子型の 6 つのブロックにわたる n 値がバーで示されています。 c – e パネル b と同じモデル由来の平均 ± 標準誤差は、遺伝子座とバックグラウンドの間の相互作用を示すために提示されました。黒軸のグラフは双方向の相互作用のみを示します。 3 番目の次元は、左下に示されている遺伝子座の遺伝子型を示す赤軸と青軸を持つ 2 つのグラフに分割されて表されます。二元交互作用の p 値がグラフに示されています。分析は生データ (ピクセル単位の PZ エリア) に対して実行されましたが、y 軸は表示のために μm2 にスケール化されました (0.0504 μm2/ピクセル) (モデルの詳細については補足ノート 11 を参照)。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

モデルを解釈するには、推定された周辺平均を比較するのが役立ちます (図 6b、補足注 11b)。 2 つの遺伝子座の遺伝的相互作用と遺伝的背景を調べると、PZ サイズの変動を説明する広範かつ強力なエピスタシスが明らかになります。前述したように（図5b）、lag-2（cgb1007）欠失は、遺伝的背景に応じて反対の表現型効果をもたらします。欠失により、JU1200ではPZサイズが大幅に減少しますが、JU751ではPZサイズが増加します（図6b）。エピスタティックな相互作用を調べると、lag-2(cgb1007) バリアントの効果は C2 と遺伝的背景の両方に大きく左右されるため、lag-2 の欠失は一連の遺伝子型全体にわたって表現型に陰性、陽性、あるいはまったく影響を及ぼさない可能性があることが示されています (図.6b–e)。同様に、C2 の表現型効果は遺伝的状況に強く依存します。C2-JU751 は、JU1200C5-lag- を除くすべての遺伝子型で PZ サイズを減少させます (図 6b - i 対 ii、v 対 vii、および vi 対 viii)。 2p(-) (図 6b—iii 対 iv)。ラグ-2欠失の存在は、JU1200バックグラウンドにおけるC2-JU751の効果を弱める(図6e'およびe")。これは、C2内の対立遺伝子が、少なくとも部分的に、ラグ-2のこの領域を介して作用することを示唆している可能性がある。 2 プロモーター. ご想像のとおり、遺伝的背景にある他のすべての未確認バリアントの複合効果が PZ 全体のサイズに最も大きな影響を及ぼしますが、この効果は、lag-2p 欠失の存在と C2 の遺伝子型に応じて著しく異なります。一般に、JU751 バックグラウンドは PZ サイズを大幅に縮小します (図 6c' および c")。ただし、lag-2 欠失が存在する場合、JU1200C2-JU1200 と JU751C2-JU1200 の間に有意な差はありません (図 6b—iv vs. v、図6c')。これは、lag-2 欠失 (lag-2p(-)) の存在下では、JU751 バックグラウンドの変異体の平均的な負の効果にもかかわらず、C2-JU1200 変異体が PZ サイズを維持するために強いプラスの効果を発揮することを意味すると解釈します (図逆に、C2-JU751 変異体はこのプラスの効果を維持できず、バックグラウンド感度が生じます (図 6d"、青線)。最後に、lag-2p 欠失 (lag-2p(+)) がなければ、C2-JU751 変異体は JU751 バックグラウンドの強い負の影響を修正しません (図 6d' 対図 6d" の赤線)。

我々のモデルは、高次のエピスタティック相互作用が C. elegans の PZ サイズの変動に寄与していることを示しています。重要なのは、観察された表現型効果の一部は、二元相互作用のみを考慮した場合にはマスクされてしまうことです (たとえば、図 6e 対 e' および e")。これらの結果は、変異体または変異体の表現型効果を解釈する際に注意が必要であることを強調しています。この効果は遺伝的背景にある他の変異に大きく左右される可能性があるため、対立遺伝子の影響を受ける可能性があり、また、C2 と遺伝的背景の効果の解釈であっても、それらは総合的な効果であり、根底にあるものによって影響を受ける可能性があるため、慎重に考慮する必要があることも強調します。エピスタティック相互作用、および場合によっては密接に関連した遺伝子座の相加効果。

私たちの研究では、生殖幹細胞システムの自然な変異と定量的な遺伝子構造を調査しています。ほんの一握りの C. elegans 野生分離株を調べたところ、生殖幹細胞ニッチ活性の変動を示す、生殖系列前駆体ゾーン (PZ) サイズの有意な違いを検出できました。我々の主な発見は次のとおりである: (1) 2 つの分離株間の PZ の自然な変動は、部分的に相互作用する複数の QTL にマッピングされる。 (2) V 染色体上の QTL には、Notch 経路を介して生殖幹細胞の運命を促進する既知の重要なシグナルである DSL リガンド lag-2 のプロモーター領域に、JU751 に特有の欠失が含まれています。 (3) C.エレガンスの生殖系列増殖活性における自然な量的変動は、生殖幹細胞ニッチのコアシグナル伝達要素の転写活性の調節を通じて生じる。 (4) 遺伝子移入および対立遺伝子置換系統により、染色体 II および V に対する 2 つの QTL の主な効果と相互作用 (lag-2 欠失) が部分的に拮抗的であり、遺伝的背景に大きく左右されることが明らかになりました。 (5) したがって、高次のエピスタティック相互作用は、生殖幹細胞ニッチ活性の自然な変動を形成します。

我々の観察は、線虫の生殖幹細胞ニッチ活性が多遺伝子構造を伴う典型的な複雑な形質であることを示唆しています。この見解を間接的に裏付ける追加の観察結果は次のとおりです。(1) PZ のサイズは、自然個体群では継続的に、そして多くの場合微妙に変化します (この研究)。（２）lag-2欠失は、PZサイズが小さい他の野生分離株では見つからなかった（この研究）。 (3) 多数の遺伝子の変異が PZ サイズを調節し、これらの遺伝子は生殖幹細胞の増殖、細胞周期の進行、分化に作用するだけでなく、多様な代謝または感覚プロセスにも作用する多様な機能を示します (25,39 で概説) ）。我々の発見と合わせて、これらの観察は、C.エレガンスのPZサイズが高次の表現型であり、多くの遺伝子座における対立遺伝子変異の影響を統合している可能性が高いことを示唆しています。私たちの例の場合、PZ サイズに顕著な違いがある 2 つの標的分離株に焦点を当て、影響が部分的に拮抗的で、全体的に遺伝的状況に強く依存する、染色体 II および V 上の大きな影響を与える遺伝子座または変異体も特定しました。これまでの研究と合わせて、これは、たとえ分子レベルで解決されたとしても（lag-2(cgb1007) 欠失など）大きな効果を持つ変異体の効果は、ネイティブのバックグラウンドでエピスタティックな相互作用が存在する場合には誤解を招く可能性があることを示唆しています。無視されます4,79。私たちの研究は、特定のバリアントが不明な場合でも、NIL バックグラウンドで対立遺伝子置換を生成することが、これらの相互作用を明らかにする効果的な手段であることを示しています。

異なる PZ サイズを持つ 2 つの親分離株に由来する F2 RIL のパネルで連鎖 QTL マッピングを実行すると、部分的に相互作用する 4 つの QTL が検出されました。我々のマルチQTLモデル選択アプローチによって同定された最良のモデルでは、QIIおよびQV QTLが相加的に作用して、調査されたRIL集団における表現型の分散の32%を説明します。しかし、遺伝子移入および対立遺伝子置換系統の分析により、これらの遺伝子座と遺伝的背景間の広範なエピスタティック相互作用が明らかになりました。遺伝子間の相互作用が集団レベルで測定される相加的遺伝的分散 (VA) の構成要素に寄与していることを考えると、この発見は驚くべきことではありません。つまり、高い VA 分散は相加的な遺伝子作用を反映している必要はありません 7,80,81,82,83,84,85,86,87。特に、個々の遺伝子座による VA の測定値は、互いに上位関係にあるすべての遺伝子座の対立遺伝子頻度に強く依存します。したがって、VA (およびエピスタティック分散を含むその他の遺伝的分散要素) の測定では、QTL が検出された場合でも、根底にあるエピスタティック相互作用、したがって遺伝形質の構造に関する情報がほとんど、またはまったく提供されません。したがって、制御された遺伝的背景における QTL の分子的性質とそれらの相互作用を特徴付けることが不可欠です。

QV QTL 領域を解析すると、JU751 の lag-2 プロモーター領域、lag-2(cgb1007) に特有の 148 bp の欠失が同定されました。この欠失により、lag-2 媒介生殖細胞増殖および生殖系列拡大の正の調節因子である HLH-2 の結合に必要な 6 つの E-box 部位のうちの 1 つが除去されます 30,73。これらの E-box 部位を変異させると、特に L3 段階での lag-2::GFP 導入遺伝子の発現が減少する (その後、生殖細胞の増殖が減少する) ことが示されました 73。したがって、我々は、lag-2(cgb1007)がHLH-2結合活性の低下によりlag-2発現の低下を引き起こすと予想した。このシナリオと一致して、この欠失をJU1200（PZサイズが大きい）に導入すると、DTCにおけるPZサイズとlag-2発現の両方が大幅に減少しました（図5b、e）。対照的に、JU751（PZサイズが小さい）のこの欠失に対応する祖先配列（JU1200）を復元すると、lag-2発現とともにPZサイズが増加するのではなく、さらに減少しました（図5b、f）。したがって、lag-2 欠失対立遺伝子は、それ自体で、遺伝的背景 (サインエピスタシス) に応じて反対の効果を発揮します。しかし、lag-2(cgb1007)欠失(C5)と染色体II QTLの中央部分(C2)との間の相互作用を調べると、C2-JU1200がこの逆転を弱めることができることが示されている(図6c'対c'')。さらに、lag-2 欠失は、両方のバックグラウンドにおける C2-JU751 の負の効果を弱めることにより、C2 の効果を修正します (図 6e' 対 e")。これは、C2がlag-2プロモーター領域、特にlag-2(cgb1007)欠失領域と相互作用することを示しています。どの遺伝子 (hlh-2、lin-39、unc-130、daf-3/daf-5、ces-1) にも結合部位または応答要素が確認されていないため、この相互作用の分子的性質に関する仮説はありません。 lag-2 プロモーター領域は C2 領域内に位置します。さらに、これらの遺伝子の一部 (lin-39、unc-130、および daf-5) にはコーディング多型 (JU1200 対 JU751) が存在しますが、hlh-2、daf-3、および ces-170 には存在しません。したがって、この遺伝的相互作用を分析するには、QII QTL を解決する必要があるでしょう。全体として、N2におけるlag-2発現にプラスの影響を与えることが以前に示されているHLH-2結合部位を含むlag-2欠失は、遺伝的状況に応じてプラス、マイナス、またはニュートラルな影響を与える可能性があります（図6）。

lag-2(cgb1007)欠失がJU751のPZサイズの減少に寄与するかどうか、またどのように寄与するかは依然として不明であるが、DTCにおけるlag-2転写物のsmFISH測定は、lag-2転写活性の違いが生殖細胞の違いに寄与することを明確に裏付けるものである。 JU751とJU1200の間で観察された幹細胞ニッチ活性。 lag-2 smFISH測定は、親分離株だけでなく、lag-2プロモーター断片が操作された相互ARLにおいてもPZサイズ測定を厳密に反映していました（図5b）。この変異体の同定と特性評価により、PZ サイズの自然な変動が、C. elegans 幹細胞ニッチで作用するコアシグナルの直接修飾によって発生する可能性があることが示されています。ただし、QV QTL 内の他の未確認の亜種からの追加の寄与を除外することはできません。同様に、AC/VU 細胞運命の仕様など、lag-2(cgb1007) を保有する株における Notch シグナル伝達 (HLH-2 によって媒介される制御を含む) が関与する他の幼虫の発育プロセスに対する明らかな影響は観察されませんでした 30,73。それらを具体的に分析したわけではないため、それらを除外することはできません。

生殖幹細胞系の活性は明らかに生物の生殖適性に関連していますが、観察された生殖細胞増殖 (および PZ サイズ) の自然な変動が生殖適性の変動に反映されるかどうか、またどのように反映されるかは明らかではありません。生殖細胞の増殖の増加は、産卵活動、子孫の生産、および卵の品質の増加と相関することがわかっています10,25,31,32,58,88,89が、この関係がどの程度因果関係があるのかは不明です。主に自己受精する雌雄同体によって生殖し、雌雄同体は順番に精子を生成し、その後残りの生涯にわたって卵母細胞を生成します。実験室条件では、これにより C. エレガンスの繁殖力は、最初に生成される自己精子の量 (約 250) によって制限されます。私たちの研究のように、PZ サイズは一般に成体の初期段階で測定されるため、おそらく観察される前駆細胞の多くは成熟卵母細胞に成長せず、自家受粉で受精することはありません。しかし、生殖細胞の増殖が増加すると、生理的細胞死（アポトーシス）を起こす卵母細胞の流量と数が上方制御され、生存する卵母細胞を提供するためのリソースが解放され、卵母細胞の品質が向上します10、25、31、32、58、88、89。したがって、成体 PZ のサイズは将来の生殖能力 (子孫の数) を直接表すものではないかもしれませんが、卵母細胞の提供の改善を通じて子孫の質を向上させる可能性があります。さらに、増殖活性の定量化によって示されるように、成体のPZサイズは、幼虫の初期段階の過去の増殖活性も反映しています（図2b、5d）。したがって、成体の PZ サイズの変動は、幼虫の発育中の生殖投資の差を反映している可能性があり、これは体細胞発育へのエネルギー配分とトレードオフになる可能性があります。

私たちの研究の標的分離株であるJU751とJU1200の生殖適応度の違いに関して、私たちは以前、自家受粉JU751雌雄同体がJU120071と比較して雛のサイズを大幅に減少させることを示しました。この減少は精子産生の違いによって引き起こされるのではなく、部分的にはJU75171の早期の殺母孵化を引き起こす主要効果変異体によるものである。それでも、JU751 のこの遺伝的変異を補正した後でも、JU120071 と比較して JU751 の雛のサイズは依然として大幅に小さいままです。 JU751 における生殖細胞の増殖の減少 (および成体 PZ の小型化) は、生殖投資の減少を反映している可能性があります。もちろん、このシナリオは非常に推測的なものであり、観察された違いが適応的である必要はありません。同様に、lag-2(cgb1007) 欠失を含む、検出された QTL が選択によって維持されているかどうかは無視します。たとえ選択的に有利だったとしても、QTL が生殖系列の増殖活性に対する影響によって選択されたのか、それとも幼虫の発育中に Notch シグナル伝達が関与することが知られている生殖系列外の追加プロセスに対する潜在的な多面発現効果によって QTL が選択されたのかは不明のままである 30,73。

ここでは、かなり小さな RIL パネル (n = 70) を使用して検出された 2 つの大きな効果を持つ QTL とその相互作用の分析に焦点を当てました。したがって、比較的低い統計検出力を考慮すると、連鎖マッピングを通じて小さな効果と追加のエピスタティック相互作用を検出することは実現不可能でした。それにもかかわらず、相反する効果を有する相互作用遺伝子座の特異的な検索により、染色体 I および X 上の 2 つの候補 QTL が得られました（図 3h）。この拮抗的相互作用のさらなる分析は、その効果量が比較的小さいこと、および染色体 II QTL、lag-2(cgb1007) と遺伝的背景の間のすでに複雑な相互作用によって制限される可能性があります。さらに、ここで明らかになったQIIとQV QTLの間のエピスタティック相互作用を完全に理解するには、さらに詳細なマッピング実験が必要です。どちらの QTL も、PZ サイズの変動に影響を与える複数の遺伝子座を保持している可能性があり、これには C. elegans に一般的と思われる、密接に関連した拮抗的遺伝子座も含まれる可能性があります 79。

これらの技術的な制限を超えて、他のいくつかの問題が私たちの調査結果の解釈を複雑にしています。まず第一に、ここで使用される F2 RIL パネルなどの人工マッピング集団は、リンクされたゲノム領域の破壊を通じて新しいエピスタティック相互作用を生成する可能性があります。これは、効果的な組換えが低く、強い連鎖不平衡を引き起こす主に自家受粉種である C. elegans に特に関係があります 74,90,91,92。最も顕著なのは、自家受粉カエノラブディティスの野生分離株間の交配により、広範囲にわたる遺伝的不適合による生存と生殖の低下による一貫した強力な異系交配抑制が明らかになった91,93,94,95,96。したがって、人工 C. エレガンス集団で生成された新規対立遺伝子の組み合わせのこのようなエピスタティック相互作用は、多遺伝子構造を含む形質に特に影響を与える可能性があります 4,17,79,97,98。言い換えれば、人工マッピングパネルで観察されるエピスタティック相互作用は、野生で発生するエピスタティック相互作用を反映している必要はありません。それにもかかわらず、彼らの研究は、形質変異の根底にある遺伝子構造についての洞察を提供します。

過去の研究と合わせて、我々の研究は、単一の遺伝的背景における個々の分子変異体の孤立した研究に基づく形質構造の一般化は誤解を招く可能性が高いという見解を強化するものである。したがって、定量的遺伝的アプローチと発生的遺伝的アプローチを組み合わせることが、エピスタティックでしばしば特異な相互作用に直面して複雑な量的形質構造を理解するために不可欠です。現在（そしておそらく長い間）最も洗練された実験でさえ、考えられるすべてのエピスタティック相互作用のほんの一部しか調べられないことを考えると、発生的および定量的遺伝的アプローチを統合することは、エピスタティック相互作用の遺伝的基盤の理解に一歩近づくための最良の選択肢を提供します。表現型とその変異。

この研究で使用したすべての C. エレガンス株は補足データ 2 にリストされています。標準的な C. エレガンス方法を使用して、大腸菌株 OP5099,100,101 を播種した 2.5% 寒天 NGM プレート上ですべての株を 20 °C で維持しました。すべての実験は雌雄同体で行われました。すべての菌株または生物学的材料は、ご要望に応じて対応する著者から入手できます。

100% 氷冷メタノールで固定し、DAPI (DAPI を含む VECTASHIELD® Antifade mounting Medium) で染色した解剖した生殖腺の画像を、CoolSnap HQ2 カメラを備えた Olympus BX61 顕微鏡を使用して撮影しました。 1 μm 刻みの Z スタックを DAPI チャネル内で 40 倍の倍率で実行しました。核は、ImageJ2 v2.9.0/1.53t102 を使用して手動でカウントされました。まず、PZ は、生殖細胞の列ごとに 2 つ以上の三日月形の核が観察できる、移行ゾーンの境界で終わる遠位先端細胞に隣接する領域として定義されました 38。画像のスタックを前駆体ゾーンから移行ゾーンの境界まで切り取り、核を数えました。

特に断りのない限り、Thermofisher の Click-IT EdU キット (カタログ: C10338) を使用して、L4 幼虫の有糸分裂生殖細胞の増殖をメーカーの指示に従って定量しました。簡単に説明すると、次亜塩素酸塩処理 (1:1:2 漂白剤:1 M NaOH:dH2O で 6 分間、その後 M9 バッファーで遠心して 3 回洗浄) によって線虫を同調させ、卵を 20 °C の M9 バッファー中で一晩孵化させました。卵をプレートあたり約 400 個の密度でプレーティングし、L4 まで発育させました。 L4中期幼虫または若い成虫（子宮内卵1～10個）を単離、洗浄し、M9緩衝液中の20 mM EdU 100μLに正確に15分間浸漬させました（PZの50～75％を染色するのに十分な時間）若者の場合）。線虫を M9 で素早く洗浄して EdU を除去し、粘着性のガラススライド (Fisherbrand™ Superfrost™ Plus 顕微鏡スライド) 上で切断することによって生殖腺を解放しました。線虫を麻酔するために少量のレバミゾールが使用されました。解剖した生殖腺をスライド上で注意深く洗浄し、4% PFA で固定し、再度洗浄しました。洗浄は、スライド上の組織に少量の溶液を直接塗布し、その後注意深く吸引することによって実行されました。 dH2Oでの最終洗浄後、組織をスライドウォーマー上で乾燥させ(35℃で5分間)、組織をスライドに接着させた。スライドを 100% MeOH に -20 °C で一晩浸漬しました。翌日、組織を PBST で再水和し、メーカーの指示に従って Click-IT EdU キットを使用して EdU 染色を実行しました。 Click-IT 染色プロトコルを 1 回繰り返した後、DAPI を含む VECTASHIELD® Antifade mounting Medium でスライドをマウントしました。イメージングは、CoolSnap HQ2 カメラを備えた Olympus BX61 顕微鏡の 40 倍の対物レンズを通して実行されました。Ｚスタックを遠位生殖腺を通して採取した（線虫当たり１つ）。 EdU 陽性および DAPI 染色された PZ 核は、ImageJ2 v2.9.0/1.53t102 を使用して手動でカウントされました。

PZ 生殖細胞数の定量化は、多くのサンプル間で PZ サイズをスコアリングする際の律速ステップとなる可能性があります。この障害を克服するために、PZ サイズを推定する簡単な方法を開発し、これを PZ セル数の代用として使用しました (図 1b および c)。簡単に説明すると、次亜塩素酸塩処理 (1:1:2 漂白剤:1 M NaOH:dH2O で 6 分間、その後遠心分離し、M9 で 3 回洗浄) によってラインを同調させました。卵を M9 バッファー中で 20 °C で一晩孵化させました。翌日、OP50 を播種した標準 NGM 培地上に卵を 400 匹/プレートの密度で播種しました。幼虫は 20 °C で若い成虫に成長しました。ほとんどの動物が子宮内に 1 ～ 10 個の卵を示したときに、プレートを洗浄することによって若い成体を収集しました。サンプルを M9 で洗浄し、氷冷メタノール中で少なくとも 5 分間固定しました。イメージング用のサンプルを準備するために、線虫を M9 で再水和し、DAPI (Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム) を含む Vectashield 封入剤を使用してスライドガラスに適用しました。若い成体の雌雄同体（子宮内に 1 ～ 10 個の胚を含む）の遠位生殖細胞系領域を、CoolSnap HQ2 カメラを備えたオリンパス BX61 顕微鏡の 40 倍の対物レンズを通して画像化しました。線虫ごとに 1 つの生殖腺腕が画像化されました。これは、たまたま対物レンズに近かった腕です。線虫ごとに 1 枚の画像が撮影されました。その断面平面は、三日月形の核が見えるように生殖巣の片側の核の大部分を捉えており、その平面内の生殖腺の形状はほとんどの平面を代表していました (図.1b)。次に、各画像の PZ サイズを定量化しました。前駆細胞ゾーンは、生殖細胞の列ごとに 2 つ以上の三日月形の核が観察できる移行ゾーン境界で終わる遠位先端細胞に隣接する領域として定義されました 38。 ImageJ2 v2.9.0/1.53t102 を使用して PZ を他のすべての組織から切り取り、しきい値ツールを使用して強調表示された PZ 核の数を最大化し、強調表示された背景を最小限に抑えました。ハイライトされたピクセルの数が PZ エリアとして記録されました。この推定方法は、PZ 核のハンド数とよく相関しています (図 1c)。

我々は、2 つの親 (JU1200 および JU75171,103) に由来する 70 個の SNP 遺伝子型別 RIL のセットにおける PZ サイズを定量化しました。ラインは 6 つの得点ブロックに分割され、8 週間にわたって得点されました。一部の株は 2 つの別々のブロックで測定されましたが、すべてが測定されたわけではありません。ほとんどの菌株は 1 回だけ測定され、菌株あたり 30 ～ 40 個体が測定されました。 2 回測定されたひずみの平均と分散は、どの測定でも同様でした。 QTL マッピングには 1 セットの測定値のみが使用されました。 PZ サイズは、補正係数を使用してブロック全体で正規化されました。補正係数は、各観測値に対する各ブロックの最小二乗平均 (lsmeans パッケージ v. 2.30-0) から導出されました (補正係数 = LSMBlockX/LSMBlock1)。正規化された PZ サイズは、ソフトウェアパッケージ R/qtl (v. 1.50)72 を使用してマッピングされました。まず、70 個すべての RIL の SNP 遺伝子型から遺伝的連鎖地図が得られました。次に、隠れマルコフモデルに基づく単一 QTL および 2 QTL の標準間隔マッピングを使用して、候補 QTL を特定しました。 LOD 閾値は、ゼロ QTL というグローバル帰無仮説の下でデータの 5,000 のランダムな並べ替えから導出された最大ゲノム全体の LOD スコアの 95 パーセンタイルに設定されました。これらの候補 QTL は、R/qtl ソフトウェアがテストされたモデルごとにペナルティ付き LOD スコアを生成するマルチ QTL モデリングの開始点として機能しました。ゼロ QTL の帰無仮説よりも優れたパフォーマンスを示すモデルは、LOD > 0 にペナルティを与えます。R/qtl の著者が推奨するように、ペナルティが最も高い LOD スコアを持つモデルを選択しました (図 3j)72。

II 番染色体上の QTL のゲノム間隔を検証するために、ほぼ同質遺伝子系 (NIL) を構築しました。 QTL 領域に JU1200 配列を持つ 2 つの RIL (RIL128/NIC728 および RIL71/NIC671) と、QTL 領域に JU751 配列を持つ 2 つの RIL (RIL127/NIC727 および RIL54/NIC654) を 10 ～ 12 世代戻し交雑して、領域を単離しました。両親の背景が逆。系統は、染色体 II QTL 内のいくつかの INDELS の PCR 遺伝子型決定に基づいて各世代で選択されました (プライマーについては補足データ 1、作成された系統とその遺伝子型については補足データ 2 を参照)。

V 染色体 QTL の lag-2 の上流にある候補 INDEL を検証するために、CRISPR/Cas-9 編集を使用し、104 によって記載されているものと同様のプロトコルを使用して相互対立遺伝子置換系統 (ARL) を作成しました。 JU1200 バックグラウンドに欠失 (cgb1007) を導入するために、染色体 II QTL (NIC1701) の大部分を通る JU751 配列を含む NIL を選択し、sgRNA (Synthego Corp.) を注入して、ラグの挿入部位の周囲に二重切断を誘導しました。 2 プロモーター (補足図 2、補足データ 1)。修復テンプレートとして機能する一本鎖ドナーオリゴヌクレオチドを同時注入しました（補足データ1）。 dpy-10 は co-CRISPR 戦略で使用されました 104。 lag-2p の置換に成功した別個の注入からの系統は、欠失の PCR 遺伝子型決定およびサンガー配列決定によって同定されました。次に、これらの系統を JU1200 と交配して、JU751 配列を含む染色体 II を分離し、JU751 バージョンの染色体 II QTL と lag-2p(cgb1007) 欠失 (NIC1713、NIC1714、NIC1715) および系統を生成しました。 JU1200 バックグラウンド (NIC1720) に lag-2p(cgb1007) 欠失のみが含まれています。 JU751 バックグラウンドの祖先の lag-2p 欠失配列 (cgb1008) を置換するために、染色体 II QTL (NIC1672) に JU1200 配列を含む NIL を選択し、ガイド RNA (Synthego Corp.) (補足データ 1) を注入して二重配列を誘導しました。挿入部位の周囲をカットします。祖先（JU1200）配列を含む二本鎖PCR産物をlag-2p（cgb1008）と同時注入して、修復テンプレートとして機能させました（補足データ1）。 dpy-10 は、104 に従って co-CRISPR 戦略で使用されました。成功した置換を含む別々の注入からの系統は、lag-2p(cgb1008) の PCR 遺伝子型決定およびサンガー配列決定によって同定されました。次に、これらの系統を JU751 と交配して、JU1200 配列を含む染色体 II を分離し、JU1200 バージョンの染色体 II QTL と lag-2p(cgb1008) (NIC1716、NIC1717、NIC1719) を含む系統と、 JU751 バックグラウンド (NIC1723、NIC1724、NIC1725) の lag-2p(cgb1007) のみ。作成されたすべての系統と遺伝子型の表については、補足データ 2 を参照してください。

線虫を上記のように漂白同調させ、適切な発育段階まで 20 °C で増殖させました。次いで、線虫をプレートから洗い落とし、１ｍＬの新しい固定液（ＰＢＳ中４％ホルムアルデヒド）中で４０分間固定した。線虫を PBS で 2 回洗浄し、1 mL の 70% エタノールに再懸濁し、4 °C で数日間保存しました。 AF594 (Custom Stellaris Fish Probes、Biosearch Tech、Teddington UK) に結合した lag-2 RNA プローブセット (Barkoulas et al. 2013) を RNase フリー TE バッファー (pH 8) に再懸濁して 100 μM ストックを作成し、その後 1 倍に希釈しました。 RNaseフリー水中：30（使用溶液）。固定された線虫を1 mLの洗浄溶液(RNaseフリー水中の10%脱イオンホルムアミドおよび2×生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液(Ambion))で3分間洗浄した。次に、ワームを 100 μL ハイブリダイゼーション溶液 (10% ホルムアミド、10% デキストラン硫酸、2x SSC) + 1 μL の lag-2 プローブ作業溶液に再懸濁し、暗所で 30 °C で一晩インキュベートしました。翌日、サンプルをすすぎ、洗浄溶液中で30℃で30分間洗浄し、洗浄溶液1 mL + DAPI (最終7.5μg/mL、Sigma)中で30℃で30分間染色した。最後に、サンプルを PBS で 2 回洗浄し、Prolong ダイヤモンド退色防止封入剤 (オレゴン州ユージーン) でスライドガラスに載せました。線虫は、100 倍の油浸対物レンズを備えた倒立 Zeiss Z.1 顕微鏡で落射蛍光下で画像化されました。すべてのサンプルに同じ照明および露出設定 (Zen 3.2 Blue Edition ソフトウェア) を使用しました。 DTC を通じて Z スタックを 0.4 μm のステップサイズで取得し、ImageJ2 ソフトウェア (NIH、ベセスダ、メリーランド州、http://rsb.info.nih.gov/ij/)102 を使用して蛍光点を手動で定量しました。

統計分析は、R Statistical Software (R バージョン 4.2.0、RStudio 2022.02.3 ビルド 492) を使用し、一般化線形混合モデル 105 を使用して実行されました。 glmmTMB パッケージ v. 1.1.3106 を使用して、データをガウスまたは負の二項 (nbinom2) モデルに適合させました。残りの診断は、開発者のガイドラインに従って DHARMa パッケージ v. 0.4.5 を使用して実行されました107。モデルの選択が保証される場合、ベイズ情報量基準 (BIC) を使用して最適なモデルが選択されました。 emmeans パッケージ v. 1.7.4-1 は、ペアワイズコントラストのモデル推定周辺平均、標準誤差、および Tukey 補正 p 値を計算するために使用されました 108。図 6 に対応する相互作用データセットのモデルフィッティングでは、modEvA パッケージ v. 3.078 を使用して D2 を計算しました。各データ分析の具体的な詳細は、統計結果を示す補足ノートの凡例に記載されています (補足ノート 1 ～ 12)。データ操作とプロットに使用されるその他の R パッケージには、tidyverse v. 1.3.1109、MASS v. 7.3-57110、ggbeeswarm v. 0.6.0111、rnaturalearth および rnaturalearthdata v. 0.1.0112、rgeos v. 0.5-9113、および sf v が含まれます。 .1.0-7114。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

すべての生データはソースデータファイルで提供されます。この研究では、次の公的に利用可能なデータベースが参照および使用されました: Wormbase WS283 (https://wormbase.org/#012-34-5) および C. elegans Natural Diversity Resource (https://elegansvariation.org/)。この論文では独自のアルゴリズムについては報告しません。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

統計分析に R パッケージを使用し、開発者のガイドラインに従ってカスタムプロットを生成するために、限定されたコードのみが生成されました (補足ノート 1 ～ 12 とメソッドを参照)。

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このプロジェクトを開始した実験的研究に貢献した Nausicaa Poullet、Anne Vielle、および Clotilde Gimond に感謝します。ディスカッション、原稿の以前のバージョンに関する有益なコメント、および技術的なアドバイスをいただいた Fabien Duveau、Marie-Anne Félix、Luke Noble、Alistair McGregor、Cltilde Gimond、Laure Mignerot、Joao Picao Osorio に感謝します。 C. elegans 株は、Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR) および Marie-Anne Félix よりご提供いただきました。また、リソースを提供していただいた CeNDR (https://elegansvariation.org/) と WormBase (https://wormbase.org/) にも感謝いたします。これらのリソースがなければ、ここで実行された分析は不可能でした。この研究は、Fondation ARC sur la recherche sur le cancer（PJA 20161205047 to CB）およびAgence Nationale de la Recherche（ANR-17-CE02-0017 to CB）からのプロジェクト助成金によって支援されました。SRFは博士研究員フェローシップによって支援されました。フランス、ニース市出身（Ville de Nice: Aides Individuelles Jeunes Chercheurs）。我々は、国立科学研究センター (CNRS)、国立サンテ医学研究院 (Inserm)、およびコートダジュール大学 (UCA) による追加の制度的支援を認めます。

Asma Sandjak、Bénédicte Billard などの著者も同様に貢献しました。

コートダジュール大学、CNRS、Inserm、IBV、ニース、フランス

サラ・R・フォーセット、アズマ・サンジャック、ベネディクト・ビラード、クリスチャン・ブレンドル

ノースカロライナ大学ウィルミントン校、生物学および海洋生物学部、米国ノースカロライナ州ウィルミントン

サラ・R・フォーセット

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概念化、SRF および CB。方法論、SRF、AS、CB。調査、SRF、BB、AS。形式的な分析と視覚化、SRF。執筆—原案、SRF。執筆 - レビューおよび編集、SRF、CB。監督およびプロジェクト管理、CB。資金調達、CB、SRF

サラ・R・フォーセットまたはクリスチャン・ブレンドルへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Eric Haag 氏、Ekaterina Voronina 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

フォーセット、SR、サンジャック、A.、ビラード、B. 他高次のエピスタシスは、生殖幹細胞ニッチ活性の自然な変動を形成します。 Nat Commun 14、2824 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-38527-0

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受信日: 2022 年 12 月 12 日

受理日: 2023 年 5 月 5 日

公開日: 2023 年 5 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38527-0

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