直接 UV による牛血清の溶血の測定

Scientific Reports volume 12、記事番号: 13523 (2022) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

血清分析における信頼性の低い結果の主な原因の 1 つである溶血を日常的に検出および定量するには、シンプルで迅速な手順が必要です。この研究では、牛血清中の溶血を迅速に測定するための 2 つの異なるアプローチを比較しました。 1 つ目は、血清サンプルの単純な直接紫外可視 (UV-VIS) 分光光度測定による溶血の推定で構成されていました。 2 つ目は、血清サンプルのデジタル画像から抽出された赤、緑、青 (RGB) カラーデータの分析と、単変量キャリブレーション (R、G、B および強度を個別に) と多変量キャリブレーション (R 、G、B、強度を組み合わせて）部分最小二乗回帰と人工ニューラルネットワークを使用します。ニューラルネットワーク法を使用した直接 UV-VIS 分析と RGB 多変量分析は、どちらも牛血清サンプルの溶血を評価するのに適していました。この手順では、良好な精度 (それぞれ 100.7 および 102.1% の平均回収率)、十分な精度 (変動係数 0.21 ～ 2.68%)、検出限界 (それぞれ 0.14 および 0.21 g L–1)、およびアップの直線性が示されました。 10 g L–1まで。

溶血は、赤血球膜の破壊とその後の細胞内容物の周囲の液体への放出です。サンプルの不適切な取り扱いや病理が原因で発生する可能性があります。溶血は通常、不適切なサンプル抽出、輸送、調製、または保管により in vitro で発生します。 in vivo での溶血はそれほど頻繁ではなく、感染症、毒性作用、免疫介在性疾患、遺伝性赤血球障害、播種性血管内凝固症候群、機械的要因、その他の要因などの病理学的状態により採血前に起こります1。 in vivo の溶血は患者に重大な結果をもたらす可能性があるため、病理学的原因の疑いをさらに調査する必要があるため、in vivo 溶血と in vitro 溶血を区別する目的で検査が行われます。

原因に関係なく、溶血は人間の臨床病理学におけるサンプル拒絶の主な原因であり 2、獣医学においても頻繁に起こる間違いである可能性があります 3。溶血は、細胞内成分の血漿中への放出、サンプルの希釈、または分光光度法や化学的干渉の生成を介して分析結果を変える可能性があります4。日常的な血液分析の結果は、溶血の程度、関与する動物種、分析に使用される方法や機器によって異なります。溶血による誤算は、アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST)、グルタミルトランスフェラーゼ (GGT)、クレアチンキナーゼ (CK)、乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH)、リパーゼ、総ビリルビン、アルブミン、グルコース、クレアチニン、尿素、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、モリブデン、セレン、亜鉛、カリウム、ナトリウム、塩化物5、6、7、8、9、10、11。鉄、亜鉛、カリウム、ビリルビンのように、一部の分析物については溶血の程度との関係が線形であるのに対し、カルシウムと塩化物などは非線形の関係を示すため、差の大きさは非常にばらつきがあり、これが重要な測定につながる可能性があります。エラー1、7。さらに、溶血はイムノアッセイや凝固検査にも影響を与える可能性があります12、13。したがって、分析前に溶血を管理することは良い習慣です。

溶血の程度に応じて色が変化するため、視覚的な検出はサンプルの溶血を判断する最も簡単な方法です。しかし、いくつかの研究 14,15 は、視覚的検査が溶血を評価する信頼性の低い手段であり、この行為が臨床上の決定に影響を与える可能性があることを実証しています 16。したがって、遊離ヘモグロビン（Hb）濃度 ≥ 0.5 g L-1 は、最も溶血感受性の高いアッセイにとって臨床的に重要であると考えられていますが 17、一部の研究者は、2 g L-1 未満の濃度を視覚的に確実に検出することは困難であると考えています 18。セラムの色には個人差があります。したがって、サンプルの目視検査では偏った結果が生じる可能性があり、血清中の Hb 濃度が 0.5 g L–1 未満が検出された場合でも、LDH や AST などの一部の分析物が影響を受ける可能性があります8。これらの理由から、不必要なサンプルの拒絶を防ぐために溶血の定量化が重要です。したがって、分析の種類ごとに必要な許容しきい値に基づいて、サンプルを拒否するか許容するかを決定するには、客観的な測定値を使用する必要があります。さらに、溶血の評価は、補正公式の使用が一般に推奨されていないとしても、パラメータの偏りの方向を示すのに役立つ可能性があります2。

溶血の程度を推定する必要性により、自動装置のメーカー (特に臨床生化学分野) は溶血指数 (HI) に基づく技術を開発するようになりました。 HI は血清の赤色に関連する測定値であり、これはほぼもっぱら、破裂した赤血球に由来する Hb によって引き起こされます。しかし、HI は利用可能なさまざまな装置でさまざまな方法で推定されており、さまざまなメーカーによる溶血の検出および定量化に使用される方法の調和が欠如しています 19。さらに、小規模で設備が整っていない研究室や、血液サンプルをたまにしか分析しない研究室には、HI を測定するための自動装置がない場合があります。したがって、本研究の主な目的は、自動装置が利用できない研究室で血清サンプルの溶血の程度を定量化する簡単な方法を開発することでした。 2 つの異なる方法で牛血清サンプルを分析しました。 1 つ目の方法は、ほとんどの研究室には通常分光測光装置があるため、紫外可視 (UV-VIS) 分光測光法による血清の色の直接測定に基づいています。溶血を推定する 2 番目の方法は、血清サンプルのデジタル画像からの RGB データに基づいています。無料の画像処理ソフトウェアを使用してサンプルのデジタル写真から RGB 情報が抽出され、これらのデータから部分最小二乗回帰または人工ニューラルネットワークによって溶血の程度の予測が行われます。この溶血測定システムは、分光光度計が利用できない小規模な現場の研究室や、サンプルの誤った分類が主な原因であるため、血清サンプルを専門の研究室に送る前に血清サンプルの適合性と品質を判断する必要がある臨床医で使用できる可能性があります。分析前段階での溶血の原因1。

データ収集は科学目的で使用される動物の保護に関する指令 2010/63/EU に従って実施され 20、試験はスペインの動物愛護法 21 に準拠しました。この手順は、サンティアゴデコンポステーラ大学 (スペイン) の Rof-Codina 獣医教育病院の生命倫理委員会によって承認されました (AELU001/21/INVMED(02)/Animal(05)/MM/01)。この研究はARRIVEガイドラインに従って報告されています。

血液は、臨床検査法の教育に使用され、サンティアゴデコンポステーラ大学獣医学部（スペイン）のロフコディナ獣医教育病院に収容されていた 10 頭の健康なホルスタインフリジアン牛の頸静脈から採取されました。

血清を取得し、溶血物を調製し、血液学的分析のために、各牛から 3 種類の血液サンプルが収集されました。 9 mL 血清チューブ (Vacuette®、CAT Serum Clot Activator、Greiner bio-one、クレムスミュンスター、オーストリア) に収集された全血サンプルを、収集後 4 時間以内に 1500 g で 15 分間遠心分離して血清を得ました。血清のチューブはさらなる分析のために –20 °C で保存されました。溶血物は、ヘパリンナトリウムを含む 9 mL チューブ (Vacuette®、NH ヘパリンナトリウム、Greiner bio-one、クレムスミュンスター、オーストリア) に採取された全血サンプルを凍結 (-20 ℃) することによって得られました。血液学的分析は、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (Vacuette®、K2E EDTA K2、Greiner bio-one、クレムスミュンスター、オーストリア) を含む 6 mL チューブに収集された全血サンプルで実行されました。

各血清サンプルを 7 つのサブサンプルに分割し、0.0%、0.2%、0.5%、1.0%、2.5%、5.0%、および 10% の溶血を生じるように溶血物の量を増加させて加えました (図 1)。溶血の程度は、1 リットルあたりの Hb のグラム数として表され、自動血球計数器で測定された各全血サンプルの Hb 濃度から計算されました。重ね合わせた個々の点を含むサンプル中の Hb 濃度と 0.0 ～ 10% の範囲の溶血度の関係を箱ひげ図に示します (図 2)。異なる個人の赤血球中の Hb 含有量と遊離血中 Hb には自然なばらつきがあるため、Hb の濃度は溶血の程度に応じてわずかに変化します。したがって、提案されたさまざまな方法で合計 70 の段階的な溶血サンプルが使用されました。

異なるヘモグロビン (Hb) 濃度を含む血清サンプルの色 (左から右へ: それぞれ 0.0、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、および 10 g L–1)。 (2022 年 5 月 24 日にサンティアゴデコンポステーラ大学獣医学部の研究室で、C. エレーロラトーレ氏が Apple Iphone 12 を使用して撮影)。

サンプルの溶血の程度に対する血清ヘモグロビン (Hb) 濃度のボックスアンドウィスカープロット。

蛍光レーザーフローサイトメトリーと層流インピーダンス技術の組み合わせに基づく自動血球計数装置 (ProCyte Dx、IDEXX Laboratories、メイン州ウェストブルック) を使用して全血球計算を行いました。血液学的パラメーターはすべての牛で正常でした 22。分光光度法による UV-VIS 測定は、Thermo Scientific Genesys 6 分光光度計 (Thermo Electron Corporation、米国マディソン) で実行されました。血液サンプルを iFuge-D06 遠心分離機 (Neuation Technologies、グジャラート、インド) で遠心分離しました。

デジタル画像は、以前の論文で詳細に説明されている社内システムで取得されました23。簡単に言うと、このシステムは、白色 LED から発せられる制御された光の下で動作するデジタルレフレックスカメラ (Canon-50D) で構成されています。カメラにはシグマ 105 mm f/2.8 マクロレンズが装備されており、メーカーが提供する制御ソフトウェア (EOS Utility 2.14.10) を使用してノートパソコンからリモート操作されました。米国国立衛生研究所が開発した ImageJ 1.52a ソフトウェア (http://imagej.nih.gov/ij で無料で入手可能) を使用してデジタル画像を処理して RGB データを取得しました。単変量および部分最小二乗回帰多変量キャリブレーション手順およびその他の統計計算は、Statgraphics Centurion XVIII バージョン 18.1.12 (Statistical Graphics、Rockville、Madison、USA) を使用して実行されました。ニューラルネットワークは、WinNN32 バージョン 1.6a (Y. Danon. Arad、イスラエル) を使用して開発されました。その他の統計計算 (傾きと切片の結合テストとして) は、統計コンピューティングおよびグラフィックス R バージョン 4.0.5 (R Foundation for Statistical Computing、ウィーン、オーストリア) 用のフリーソフトウェア環境上のライブラリ Ellipse を使用して実行されました。

ヘモグロビンは赤血球の主要な細胞内分子であるため、血液サンプルの溶血の程度を示す最良の指標となります。段階的溶血サンプル中の Hb 濃度は、実験室用アッセイキット (Spinreact、スペイン、ジローナ) を使用したシアンメトヘモグロビン法 (Hb 濃度測定の国際基準法) によって測定されました。基本的に、Hb はフェリシアン化カリウムによってメトヘモグロビンに酸化され、メトヘモグロビンはシアン化カリウムによってシアンメトヘモグロビン (CNMHb) に変換されます。形成される色の強度 (UV-VIS 分光測光法により 540 nm で測定) は、サンプル中の Hb 濃度に正比例します。以下の 2 つのセクションで説明する提案された方法を使用して得られた結果は、この CNMHb ベースの手順によって生成された結果と比較されました。

ヘモグロビンは、この化合物およびその誘導体の主要な吸光度ピークの 1 つである 540 nm での血清サンプルの直接分光測定によって推定できます。本研究では、この直接測定法を段階的溶血サンプルの希釈 (1:10) に適用しました。

この方法は、サンプルの単一のデジタル画像によって提供される色情報に基づいています。溶血した血清サンプルを分光光度計キュベット (1.75 mL) に入れ、カメラの焦点面から一定の距離 (15 cm) に保持しました。すべての場合において、画像は、固定カスタムホワイトバランス (5200 K)、絞り f2.8、露出時間 1/10 秒、および 100 ASA 写真感度の設定で、キュベットの中心点をターゲットにしたマニュアルフォーカスを使用してキャプチャされました。画像は、カメラの望ましくない動きを防ぐためにコンピュータベースの遠隔操作によって取得され、すべての画像は非圧縮の JPEG ファイルとしてコンピュータのハードディスクに直接保存されました。以前の実験では、raw ファイルや tiff ファイルなどの他の形式よりも jpeg 形式が好ましいことが実証されました 23。 jpeg ファイルから抽出された RGB ヒストグラムは、raw ファイルや tiff ファイルよりも小さなファイルに色情報が保持されているため、処理が高速になり、使用するディスク領域が大幅に少なくなります。 R、G、B および重み付けされた強度の値は、多次元画像用に設計されたオープンソースの画像処理プログラムである ImageJ を使用して写真から抽出されました。各サンプルについて、赤、緑、青の色の強度を示す RGB 値が、ImageJ ソフトウェアを使用して各画像から抽出されました。各強度値は 0 ～ 255 (256 チャンネル) のスケールで表され、チャンネル番号が大きいほど色が明るいことを示します。分析信号とみなされる色の値は、Hb の濃度に関連しています。このケースでは、2 つの異なる校正手順がアッセイされました。i) R、G、B、および強度の値のそれぞれによる単変量校正。 ii) 部分最小二乗回帰 (PLSR) および多層フィードフォワード人工ニューラルネットワーク (MLF-ANN) による、4 つの R、G、B および強度変数すべてに基づく多変量キャリブレーション。

データ行列 (X70x7) がサンプルデータから構築されました。すべての場合において、行 (70) は溶血血清サンプルに対応し、列 (7) はサンプルを特徴付ける 7 つの変数の数値に対応します。 (2) CNMHb 法により測定された Hb の値。 (3) UV-VIS 分光測光法により 540 nm で測定されたサンプルの吸光度。 (4 ～ 7) それぞれ、R、G、B の値、および ImageJ ソフトウェアを使用してデジタル画像から得られた重み付けされた強度。

データマトリックスは、Hb 濃度と考慮された分析信号の間の関係を調査するために、さまざまな単変量および多変量の化学測定キャリブレーションを受けました。直接 UV-VIS 分光測光法では、540 nm での吸光度および CNMHb によって決定された Hb 値に対して一変量校正が実行されました。 RGB 手順では、一変量キャリブレーションと多変量キャリブレーションの両方がアッセイされました。単変量アプローチでは、R、G、B および加重強度値が CNMHb-Hb の値に対してプロットされました。多変量キャリブレーションでは、4 つの予測子 X 変数 (R、G、B および加重強度) のセットと 1 つの依存 Y 応答 (Hb 含有量) が考慮されました。 2 つの異なるアプローチ (PLSR と MLF-ANN) を使用して、予測用の異なる数学モデルを構築しました。 PLSR メソッドには、X 変数と Y 応答の間の複雑な関係を導き出すことが含まれます。予測 (交差検証によって決定) のために、限られた数の潜在因子 (LF) が PLSR によって構築されました。 LF は、Y 応答の大きな変動に関連する因子空間内の方向に関連付けられており、最良の予測を取得するようにバイアスされています (より詳細な説明については、Geladi と Kowalski24 を参照)。一方、MLF-ANN は、一連の入出力サンプル (RGB カラーデータと Hb コンテンツ) に基づいてモデルを開発し、ニューロン接続間の重みを更新および変更して、適切な出力を生成する強力なパターン認識技術です。それぞれの入力。したがって、接続の重みは、入力カラーデータと出力 Hb 含有量の間の関係に関する有用な情報を提供します。ただし、この情報は化学的に解釈できません25。

検証戦略は、単変量アプローチと多変量アプローチでは異なりました。単変量法の場合、70 個のサンプルのセットがキャリブレーション (49 個のサンプル: 全体の 70%) と検証 (21 個のサンプル、30%) のサブセットに分割されました。各サブセットへのサンプルの割り当ては、異なる Hb 濃度を考慮してランダムに実行されました。このサンプル配置により、一変量モデルの構築と残りのサンプルによる適切な検証に十分な情報が提供されました。多変量キャリブレーション (PLSR および MLF-ANN) の場合、モデルは可能な限り多くの情報を使用して構築される必要があります。最適な状況は、2 つの独立したキャリブレーションと MLF-ANN を確立するのに十分なサンプルが得られる多数のサンプルがあることであることは事実です。学習と検証のための大規模なセット。このケースでは、利用可能なサンプルの数が限られているため、サンプルサイズの減少に関係なく、堅牢で偏りのないパフォーマンス推定値を生成する入れ子になった相互検証手順が必要になります 26。サンプルの 90% は予測モデルの構築に使用され、残りの 10% は検証に使用されます。このセットの分布に従って、トレーニングセットと検証セットの異なる構成を使用して 10 重にネストされた相互検証手順が実行され、両方のセット間の独立性が確保され、各ステップで異なるモデルが開発されました。次に、全体的なパフォーマンスは、モデルの開発には関与しなかった検証データの異なる 10% セットに対する、個別に開発された 10 個のモデルの分類パフォーマンスの平均として計算されました。精度は、3 回の反復測定の 10 測定の変動係数 (CV = SD/\(\stackrel{\mathrm{-}}{\text{x}}\)*100) を評価することにより、中間再現性アッセイの観点から評価されました。異なる濃度レベル (0.5、2.5、および 10%)、異なる血清サンプルを使用して調製され、異なるオペレーターが測定されました。開発されたすべてのメソッドの応答の直線性は、最大 10% の Hb 含有量についてテストされ、検出限界 (LOD) は 10 個 (n = 10) の血清ブランクの標準偏差の 3 倍、LOQ は 10 倍として計算されました。。精度は、開発された各方法で得られた Hb 濃度と CNMHb 法で得られた Hb 濃度を比較することによって評価されました。

研究は関連するガイドラインと規制に従って行われます。

49 個の校正サンプルを使用して、牛血清サンプルの Hb 濃度と 540 nm での吸光度の関係を確認しました。この関係はランベルト・ベールの法則に従い、吸光度 = (0.1051 ± 0.0075) + (0.0873 ± 0.0017) (Hb)、相関係数 0.991 で記述される線形モデルを示します (図 3a)。この結果は ANOVA によってもチェックされ、吸光度と Hb の間の直線関係が有意であることがわかりました (P < 0.05)。

(a) 直接 UV-VIS 分光測光法の校正セットから作成されたヘモグロビン (Hb) 濃度の校正曲線。 (b) 検証サンプルの直接 UV-VIS 分光測光法を使用したヘモグロビン (Hb) 濃度レベルの予測と、CNMHb 法によって提供されたものとの比較。

牛血清サンプル中の吸光度と Hb 濃度の間の適切な線形関係が実証されると、メソッドの精度、精度、直線性、LOD および定量限界 (LOQ) に関する分析の性能指数を確立するためにさまざまな研究が実行されました。。精度は、検証セット内の 21 個の既知のサンプルの Hb 濃度を予測することによって評価されました。これらのサンプルの 540 nm での吸光度を測定した後、得られた検量線を使用して Hb 濃度を予測しました。 UV-VIS によって測定された Hb 濃度を、CNMHb 法を使用して測定した濃度に対してプロットしました（図 3b）。線形回帰は、おそらく、さまざまな分析手法を比較するために使用される最も一般的なアプローチです。このアプローチに基づいて、2 つのアッセイ方法が同等の結果を提供する場合、テスト方法と参照方法の間の回帰直線は、等値線 (1 に等しい傾きと切片によって特徴付けられる) と大きく変わらない直線を生成するはずです。 0に等しい)。等価線からの逸脱は、2 つの方法の間に一致がないことを示します。このケースでは、UV-VIS によって測定された Hb 濃度と参照方法によって得られた濃度の間の線形回帰により、最小二乗回帰式が UV-VIS 予測値 = (0.0816 ± 0.1257) + ( 0.9688 ± 0.034) * (Hb)、相関係数は 0.988。結果の直線は等価直線に近くなります。傾き (0.935 ～ 1.0032) と切片 (－ 0.0441 ～ 0.2073) の 95% 信頼区間には、それぞれ値 1.0 と 0.0 が含まれます。したがって、UV-VIS 測定によって得られる結果は、CNMHb 法によって得られる結果と同等です。この結果を検証するために、2 つの方法で得られた Hb 濃度を比較するペアテストを実行しました。検証セット内の 21 個のサンプルについて、差の平均 \({\overline{\text{X}}}\)d は 0.0115、差の標準偏差 Sd は 0.455 でした。これらのデータによると、tcal = (\({\overline{\text{X}}}\)d \(\sqrt{\mathrm{n}}\))/Sd の値は 0.116 でした。 tcal は t(95%, n−1) 未満であるため、UV-VIS 法が参照 CNMHb 法によって達成された結果と同等の Hb の結果をもたらしたことが確認できます (有意水準は 0.05)。実際、UV-VIS 測定による検証からのサンプルの平均回収率は 93.6% でした (表 1 を参照)。

RGB 法の場合、単変量キャリブレーションと多変量キャリブレーションという 2 つの異なるキャリブレーションアプローチが適用されました。キャリブレーションセット内のサンプルの画像から抽出された 4 つの色パラメーターに対して一変量キャリブレーションをテストした場合、G、B、および強度の値は Hb 濃度と十分な相関関係がありませんでした。 Hb 濃度と線形関係を示す唯一の色変数は、R 変数 (赤の色調に対応) でした。血清溶液の色が赤色の範囲（黄オレンジ色から濃い赤まで）にあるため、この結果は予想されました（図 1）。

UV-VIS 法で得られたものと同様の分析シグナルを使用して検量線を提示する目的で、生の R 分析シグナルが Redbance (吸光度と同様) に変換され、次のように計算されました。

ここで、R は対象サンプルから抽出された R データの値、256 は赤色の範囲の RGB チャネルの総数です。分析信号にこの大きさを使用すると、Redbance は無色の溶液の 0 から最も暗い赤色の溶液の 2.4 の間で変化します。この分析信号によると、Redbance と牛血清サンプル中の Hb 濃度の関係は、Redbance = (0.0929 ± 0.0021) + (0.0187 ± 0.0005) (Hb) で表される直線関係に従い、相関係数は 0.983 でした。ただし、これらの結果から推論され、図4aに見られるように、結果はUV-VISの結果ほど満足のいくものではなく、キャリブレーションサンプルのデータのばらつきが大きいことが示されました。決定された Hb 濃度と基準値の回帰直線 (図 4b) は、等直線とはわずかに異なる直線であり、実際、傾きの信頼区間 (0.824 ～ 0.914) には、値は 1.0。これにより、Hb 濃度が 5% 未満の値では過大評価され、5% を超える値では過小評価されます。

(a) RGB 単変量法 (R ベース) の校正セットから作成されたヘモグロビン (Hb) 濃度の校正曲線。 (b) 検証サンプルの RGB 単変量法 (R ベース) を使用したヘモグロビン (Hb) 濃度レベルの予測。CNMHb 法によって提供されたものと比較します。

多変量キャリブレーションでは、4 つの色変数に基づいて血清中の Hb 濃度を予測するための数学的モデルを構築するために 2 つの異なる手順が使用されました。 1 つ目は PLS 回帰に基づいており、2 つ目は MLF-ANN を使用しました。

PLSR は、4 つの X 変数 (R、G、B および加重強度) と Y 応答 (Hb) を含むデータマトリックスの 70 サンプルに適用されました。このケースでは、方法セクションで説明したように 10 倍の相互検証が実行されたため、キャリブレーションセットと検証セットの間の以前の分割は削除されました。モデルはサンプルの 90% で構成されるトレーニングセットに適合され、検証セット内のサンプルの 10% を予測するために使用されました。すべてのサンプルが少なくとも 1 回は検証セットに含まれることを保証するには、このプロセスを 10 回繰り返す必要があります (この検証戦略には明らかに高い計算コストがかかります。ただし、これは現在のコンピュータプロセッサや最新の化学測定パッケージでは問題ありません)この手順を自動化できます)。本研究では、合計 X 分散の 99.9% と Y 分散の 98.1% を保持する 3 つの LF モデルランクが最適なものとして選択されました。予測における応答の説明された分散は 97.6% でした。基準 Hb 値に対する検証サンプルの予測値を図 5 に示します。結果は明らかに単変量アプローチの改善です。得られた線形方程式は次のとおりです。PLSR 予測値 = (0.051 ± 0.0.069) + (0.9807 ± 0.0170) (Hb)、R = 0.990。得られた直線が等値線 (傾き = 1、切片 = 0) と互換性がある場合、これは、RGB-PLSR メソッドが参照メソッドと同等の結果を生成することを意味します。このエンドポイントを検証するために、切片 β0 と傾き β1 (楕円) の共同信頼領域の定義に基づくテストが適用されました。このケースでは、95% 信頼領域に β0 = 0 および β1 = 1 が含まれる値が得られました。その後、95% の信頼水準で RGB-PLSR 法により、ヘモグロビン測定の参照 CNMHb 法と互換性のある結果が得られました。したがって、4 つの色の変数には、Hb 濃度を適切に予測するのに十分な情報が含まれています。 RGB ベースのモデルの予測能力を強化する試みとして、多層フィードフォワード人工ニューラルネットワークを使用して別の多変量キャリブレーションが構築されました。

検証サンプルの RGB-PLSR 法を使用したヘモグロビン (Hb) 濃度レベルの予測を、CNMHb 法によって提供されたものと比較します。

このセクションでは、MLF-ANN を使用して、同じ 4 つの色変数の生データに基づいて Hb 濃度を予測しました。 MLF ネットワークのニューラルアーキテクチャは次のように選択されました。入力層は 4 つのニューロン (入力色変数の数と同じ数) で構成され、出力層は 1 つのニューロンで形成され、ネットワークによって予測された Hb 値が得られました。隠れ層の数とサイズは、完全なデータセットの最小二乗平均平方根誤差 (RSE) に基づいて選択されました。最低の RSE は 3 層 (4-7-1) のニューラルネットワークを使用して達成され、さらなる計算に使用されました。 2 つの隠れ層を備えた他のネットワークアーキテクチャでも同様の RSE が提供されましたが、3 層の最も単純な構造が好まれました。出力の計算に使用される伝達関数はシグモイドです: f(x) = 1/(1 + [exp(–x)])。ニューロン間の接続の初期の重みは、3 ～ - 3 の範囲でランダムに選択されました。適応学習率パラメーター η と運動量 i (各エポックの後に接続の重みを更新するパラメーター) はそれぞれ 0.2 と 0.5 でした。過学習を防ぐために、最大エポック数は 500 に制限されました。検証のために、上記のように 10 倍の相互検証が適用されました。 MLF-ANN によって予測された血清 Hb 濃度を図 6 に示します。ANN は PLSR よりもさらに優れた結果を提供します。 ANN 予測値と参照 Hb 濃度の比較は適切で、ANN 予測値 = (0.0270 ± 0.0348) + (0.9916 ± 0.0083) (Hb) の近似線に従い、相関係数は 0.997 でした。等価線との互換性は、前セクションと同じテストを使用して明確に実証されました。したがって、最適化されたニューラルネットワークは、生のカラーデータから有用な情報を抽出し、参照 CNMHb 法によって測定される血清サンプル中の Hb 濃度を正確に予測できます。

検証サンプルの RGB-MLF-ANN メソッドを使用したヘモグロビン (Hb) 濃度レベルの予測を、CNMHb メソッドによって提供されたものと比較します。

上述の方法の予測能力の観点から表現される精度の評価に加えて、3 つの濃度レベルでの精度、LOD、直線性などの他の分析性能指数もテストされました。得られた結果を表 1 にまとめます。UV-VIS 法では、CNMHb 手順と比較して適切な結果が得られました。したがって、540 nm での吸光度の測定は、牛血清の溶血を評価する迅速かつ簡単な方法です。 LOD は開発されたすべての手順の中で最も低く、実際の Hb 濃度に対する吸光度の直線性は最大 10% でした。 Redbance として測定された赤色チャネルの応答に基づく RGB 単変量法では、検証サンプルの予測が低い値の Hb 含有量を過大評価し、高い値を過小評価したため、満足のいく結果が得られませんでした。この直接色ベースの単変量法でも、精度に関して悪い結果が得られました (特に 1% 未満の濃度値の場合)。したがって、RGB 多変量アプローチにより、得られる結果が改善されました。 PLSR および MLF-ANN キャリブレーションに基づく両方の多変量 RGB メソッドで得られた予測では、CNMHb メソッドと同様の結果が得られました。ただし、PLSR 法による予測の精度、したがってこの方法による回収率は、値が低い場合には非常に悪かった。対照的に、ニューラルネットワークを使用したキャリブレーションでは、CV が 0.10 ～ 5.56% の範囲で、精度に関して適切な結果が得られました。さらに、RGB-ANN 法の線形応答により最大 10% の Hb が得られ、CNMHb 法と比較した平均回収率は 102.3% でした。

Hb 濃度を測定することによりウシ血清サンプルの溶血を判定するための 2 つの色に基づく方法がテストされました。直接 UV-VIS 分光測光法と RGB-MLF-ANN 法の両方で満足のいく結果が得られ、CNMHb 参照法で得られた結果と統計的に同等の結果が得られました (P < 0.05)。どちらの場合も、性能指数は適切であり、通常血液検査結果に影響を与える最小レベルである 0.50 g L-1 で溶血が検出されました 17。

Hb は貧血や体外溶血を示すために使用されるため、Hb を測定する多くの方法が開発されています。これらはどちらも人間の医療において重要であり、頻繁に発生します。歴史的に、Hb 測定は、設備の整った検査室と、国際血液学標準化委員会 (ICSH) による Hb 濃度測定の参照方法である CNMHb 法などの化学手順の使用に依存してきました27。このアプローチは、Hb の最も安定な誘導体であるシアンメトヘモグロビン 28 の 540 nm での吸光度の測定に基づいています。ただし、ICSH は、血液学的検査法の標準化を目的とした国内委員会、または政府によって任命された公的保持者のみにこの検査法の使用を推奨しています。この方法を溶血試験に使用すると、時間がかかり、有毒な残留物が生成されるため、現実的ではありません。それにもかかわらず、この方法は一部の国では依然として頻繁に使用されています29。

現在、世界中の研究室は、臨床病理学においてこの現象の発生率が高く重要であるため、サンプル中の溶血を体系的に検出することを目指しています。この手順はあらゆるタイプの研究室で実行されることを目的としているため、溶血を検出および定量化する、より迅速かつ簡単な方法が開発されています。分光分析は遊離 Hb を評価する最良の方法と考えられており、HI の標準的な使用は複数のガイドラインで提案されています 2,30 が、この推奨事項は十分に評価されていないという一般的な認識があります 19。 HI は、異なる波長ペア (570 と 600 nm、または 660 と 700 nm など) で血清または血漿サンプルの吸光度を測定することによって溶血の程度を計算します。この方法は現在、ほとんどの大型ワークステーションに組み込まれています。多くの分光分析法では、黄疸または脂肪血症のサンプルで 2 つ以上の波長を使用して、単一波長の結果で観察される干渉を防ぎます。

古典的な研究では、Malinauskas ら 31 がウシサンプルを使用して、2 つおよび 3 つの波長を組み合わせた 9 つの異なる分光測光法と、血漿中の Hb を測定する他の 2 つの化学的方法を比較しました。これらの著者は、分光分析法は化学物質の添加を伴う方法よりも安全で、簡単で、より正確で正確であると結論付けました。これらの異なるアプローチが可能となるのは、Hb 吸収スペクトルにより、420 および 540 nm 付近に少なくとも 2 つの主要な特性最大値がある、広い波長範囲での Hb の推定が可能になるためです32。ヒトおよび他の動物種の溶血を評価する他の研究で良好な結果が得られているため、この研究では UV-VIS 直接分光測光法の設計に 540 nm のピークが選択されました 7,33,34,35。これらの主ピークに近い他の波長も使用されています。人間の医学では、血清中の低レベルの溶血を測定するための λ = 414 nm に基づく分光光度法が、溶血性サンプルを識別する信頼できる方法であることが実証されています 36。この場合、提案手法により 0.004% の溶血を検出することができました。酸素分圧 (PO2) に基づいて Hb の吸光度ピークの潜在的な変動を研究した他の著者は、PO2 が 100 mm Hg より高い場合、576 のピークも有用である可能性があると結論付けています 37。ヒトとウシのオキシヘモグロビンの吸収スペクトルにはわずかな違いが見られるだけであり 38、したがって、ここで紹介する UV-VIS 法で実証されているように、これらの研究で使用される分析技術と波長はウシの患者にも有効であるはずです。この最初の方法では、540 nm での吸光度の一変量校正と、我々の経験では Hb 含有量を比較することで、ウシ血清サンプルの溶血を適切に予測するのに十分でした。ただし、開発された 1 波長アプローチには次のような弱点があります。(1) 単一波長で実行されるキャリブレーションでは、分析信号がターゲット分析物 (この場合は Hb) のみからのものなのか、それともマトリックス（血清）中に存在する何らかの干渉物質によるもので、測定信号を増減させる可能性があります。 (2) 野外測定の実行が困難であること、および脂肪血症および黄疸症のサンプルにおける血清の色の変化による干渉の可能性があること。これらの考慮事項にもかかわらず、得られた結果に基づいて、単一波長に基づいてここで適用された手順は、検証されていることに加えて、簡単で迅速で経済的で非破壊的で利用可能な測定技術であるため、適切であると考えられます。牛血清サンプルの溶血。

分光測光法は現場の専門家や小規模な獣医学研究室には実行不可能である可能性があることを念頭に、単純なデジタル機器で取得したサンプルのデジタル画像から抽出した RGB データに基づく 2 番目の方法が開発されました。この方法を携帯電話またはその他のモバイルデバイスに実装すると、専門の研究室にサンプルを送信する前にサンプルの品質を検証するための貴重なツールが現場の専門家に提供されます。評価されたさまざまなアプローチのうち、多変量 RGB-MLF-ANN 法が Hb の測定に最良の結果をもたらしました。 RGB-MLF-ANN の分析性能指数は、UV-VIS 法で得られたものよりわずかに劣っていましたが (2.5% 溶血の精度が低く、LOD がわずかに高かった)、この手順で得られた結果も許容可能であり、結果と同様でした。 CNMHb 法によって得られます (P < 0.05)。したがって、この方法は溶血の信頼性の高い測定に使用できます。デジタルカメラや電話などの一般的なツールは、科学分野で使用されることが増えています。これらの比較的安価な機器には、そのような作業に必要なハードウェアとソフトウェアが含まれているからです。 RGB データは、古いワインの異物混入の検出 23 や、血液、ワイン、水中の鉄含有量の測定 39 など、さまざまな分析タスクを実行するために使用されています。獣医学では、RGB データを提供するカメラにより、牛の個体識別 40,41、牛の心拍の測定と制御 42、家禽の肉と内臓の分割 43、鶏の胸肉の腐敗の検出 44 などの方法の開発が可能になります。医療分野では、さまざまなデバイスが、侵襲的方法 45,46 と非侵襲的方法 47,48,49,50 の両方で、ヒトの Hb を測定するために分光測定または RGB データを使用しています。これらの機器や装置のほとんどは、人間の患者の貧血を検出するために設計されていますが、RGB 電話ベースの方法は、インビトロおよびインビボの溶血を検出するためにも適用されています51。 Archibong ら 52 は、RGB 値を使用して携帯電話法で生体内溶血を検出しました。その精度は血漿サンプル中の Hb の 0.01 g L–1、相関係数 R2 = 0.9703 でした。 Lopes ら 53 は、コンピュータービジョンとニューラルネットワーク (NN) を使用する方法を開発しました。 NN をトレーニングした後、Hb の値 0.4 g L–1 が決定されました。この装置は、血液検査の前分析段階で検査室の決定を導くのに十分な精度で溶血を推定しました。 NN の使用は、非線形性、教師あり学習、適応性、およびコンテキスト情報に関するデータ解釈に利点をもたらします。これらの理由から、NN はサンプルの溶血を評価するための多変量予測ツールとして、また部分最小二乗回帰 (PLSR) などの他のよく知られたキャリブレーションアプローチとして使用されてきました。したがって、Kim et al.54 は、PLRS をうまく使用して、3 色センサーカメラで牛の第三の目から得られた RGB データから再構成された反射率スペクトルによって血中 Hb レベルを定量化しました。この研究では、著者らは血中 Hb を測定するための R チャネルのみの相関も測定し、このチャネルは Hb と関連しているものの (P = 0.047)、相関係数が低すぎると結論付けました。この発見は、R チャネルは Hb 含有量に関連している可能性があるが、一貫した堅牢な結果を得るには多変量アプローチの適用が必要であるという考えを裏付けています。ここで評価した RGB 単変量法では、R チャネルのみの使用も検討されました (赤色により Hb との関係が予想されるため)。ただし、結果は Kim et al.54 によって得られた結果よりも優れていましたが (R チャネル手順の R2 = 0.260 と比較して、直接 R チャネル手順の R2 = 0.973)、適切な精度が不足していました (データの分散が大きいため)。キャリブレーションサンプルの場合）、Hb 濃度の 5% 未満の値の過大評価、および 5% を超える値の過小評価は、この方法の使用を除外します。順方向学習を備えた多層ニューラルネットワークの使用を含むアプローチは、低コストのカメラ (この研究で使用されているものより解像度が高い) に基づく新しい手順の開発や、牛の溶血を検出および定量化するための携帯電話アプリケーションの開発にも使用できる可能性があります。デジタル画像から。これにより、現場で働く獣医師に、ウシサンプルの溶血の程度を迅速に推定するための、シンプルで高速かつ使いやすいツールが提供されます。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、臨床施設および分析施設を利用してくださったロフ・コディナ獣医教育病院およびサンティアゴ・デ・コンポステーラ大学RIAIDT-USCのスタッフに感謝の意を表します。

サンティアゴ・デ・コンポステーラ大学獣医学部、解剖学、動物生産および臨床獣医学科、キャンパス・テラ、27002、ルーゴ、スペイン

ベレン・ララン、マルタ・ミランダ、ルーカス・リゲイラ、マリア・ルイーサ・スアレス

獣医教育病院 "Rof-Codina"、サンティアゴデコンポステーラ大学獣医学部、キャンパステラ、27002、ルーゴ、スペイン

ベレン・ララン、マルタ・ミランダ、ルーカス・リゲイラ、マリア・ルイーサ・スアレス

サンティアゴ・デ・コンポステーラ大学獣医学部動物病理学部門、キャンパス・テラ、27002、ルーゴ、スペイン

マルタ・ロペス・アロンソ & ビクトル・ペレイラ

サンティアゴデコンポステーラ大学理学部、分析化学、栄養および臭素学部門、化学生物学分析研究所、キャンパステラ、27002、ルーゴ、スペイン

カルロス・エレーロ・ラトーレ

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BL、MLA、MM、CHL が実験を発案し、BL、MLA、MM、CHL、VP、MLS、LR が実験を実施し、サンプルの採取に関与しました。データは CHL によって統計的に分析され、原稿は BL、MLA、CHL によって執筆されました。すべての著者が原稿の最終版を読んで承認しました。

マルタ・ミランダへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

ララン B.、ロペスアロンソ M.、ミランダ M. 他直接 UV-VIS および RGB デジタル画像ベースの方法による牛血清の溶血の測定。 Sci Rep 12、13523 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-17842-4

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受信日: 2021 年 12 月 21 日

受理日: 2022 年 8 月 2 日

公開日: 2022 年 8 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17842-4

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